昆虫分子科学课程论文

昆虫分子科学课程论文题目：抑制性消减杂交技术在昆虫滞育中的利用专业：植物保护姓名：学号：抑制性消减杂交技术在昆虫滞育中的利用罗伟西南大学植物保护学院，重庆400715摘要：抑制性消减杂交技术是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术.其原理是以抑制性多聚酶链反应(PCR)反应为基础的cDNA消减杂交技术.通过合成两个不同的接头，连接于测试cDNA片段的5’末端，达到选择性扩增差异性表达的cDNA片段，抑制非目的cDNA的扩增.该技术与其他消减杂交技术相比，因具有假阳性率低、敏感性高、效率高等优点而得到广泛应用。滞育是多数天敌昆虫固有的遗传属性，掌握天敌昆虫滞育诱导、维持和解除技术，能及时将扩繁的天敌昆虫以滞育状态进行储存，在释放前再打破滞育使其进入活跃状态以防控害虫。本文就抑制性消减杂交技术在昆虫滞育中的应用作一综述。关键字：抑制性消减杂交技术；昆虫；滞育；原理；应用UtilizationofSuppressionSubtractiveHybridizationininsectdiapauseLuoWeiSouthwestChinaNormalUniversity，Chongqing400715，ChinaAbstract：Suppressionsubtractivehybridizationtechnologyisakindofidentification,geneexpressionoftissuecellsinthetechnologyofselectiveseparation.Itsprincipleisbasedontheinhibitionofthepolymerasechainreaction(PCR)reactionbasedsubtractivehybridizationofcDNA.Throughthesynthesisoftwodifferentjoints,5'endconnectedtothetestofthecDNAfragmenttofragmentcDNAselectiveamplificationdifferentialexpressionandamplificationofcDNA.Thepurposeofsuppressingtechnologycomparedwithothersubtractivehybridization,becauseofitslowfalsepositiverate,highsensitivity,highefficiencyandwidelyused.Diapauseistheinherentgeneticpropertyofmostnaturalenemyinsectswhichmasterthenaturalenemyinsect'sdiapauseinduction，maintenanceandbreak.Inthisstate，diapausednaturalenemiescanbestoredtimely，andthenbreakdiapausebeforereleasingitinordertopreventandcontrolpests.Theapplicationofsuppressionsubtractivehybridizationininsectdiapauseisreviewedinthispaper.Keyword：Suppressionsubtractivehybridization；Insects；Diapause；Principle；Utilization抑制性消减杂交技术是近年来发明的用于挖掘差异性调控或特异表达cDNA探针和构建文库的一种高效有力的方法，该技术具有灵敏度高、快速简便、实验周期短、假阳性率低、特异性高等诸多优势，迅速广泛地应用于农业、医学等生物科学研究领域。抑制性消减杂交技术特别适用于遗传背景相似度高的样品，极大地增强了差异性表达的低丰度基因和基因片段的获取，简化了测试过程，在一轮消减杂交过程中不仅抑制普通cDNA的扩增，同时使稀有转录本得到1000倍以上的富集，由于这些特性，也使此方法广泛应用于寻找昆虫特异表达新基因。1抑制性消减杂交技术1.1抑制性消减杂交技术的原理抑制性消减杂交技术是一种以抑制性PCR反应为基础，将标准化测试cDNA单链步骤和消减杂交步骤合为一体的技术。通过合成两个不同的接头，接于经限制性内切酶消化后的测试cDNA片段的5’末端，将测试和驱动进行两轮杂交。标准化步骤均等了测试中的cDNA单链丰度，消减杂交步骤去除测试和驱动之间的共同序列。利用抑制性PCR选择性扩增目的cDNA片段，同时抑制非目的cDNA的扩增。因此，抑制性消减杂交技术显著增加了获得低丰度差异表达的cDNA的概率。所谓抑制性PCR是利用链内退火优于链间退火，使非目的序列片段两端的长反向重复序列在退火时产生“锅柄样”结构，无法与引物配对，从而选择性抑制非目的序列片段扩增（SiebertPDetal.，1995）。抑制性消减杂交技术的基本实验过程如下：首先，将要进行比较的两种组织或细胞来源的mRNA样品反转录为cDNA,把含有目的基因的cDNA称为测试，把参考cDNA称为驱动，用同一种限制性内切酶RsaI切割，产生末端平头的片段，将测试cDNA分为两份,每份连接不同的接头,即:接头1和接头2。接头为双链DNA片段，且5’-端均无磷酸基，这样保证只有接头中的长链可以与cDNA的5’-末端连接，两个接头含有可识别的序列.接下来进行两次杂交。第一次杂交在每个测试里加入过量驱动，然后变性、退火，根据杂交动力学第二定律，即丰度越高的分子退火速度越快，因此测试cDNA与驱动cDNA相同片段大都形成异源双链分子，使得差异表达的单链分子得到富集。第二次杂交，将进行过首次杂交的两组样品不经变性而直接混合，只有剩下的经过消减并平均化了的差异表达的单链cDNA可以重新结合为新的杂交体分子，这种杂交体分子两端带有不同的接头1和接头2，加入新鲜变性的驱动进行第二轮消减杂交，进一步富集差异表达的杂交体分子，并用DNA酶补平末端，这样差异表达的测试序列-杂交体分子5'-和3'-端就有了进行巢式PCR所需的不同的退火位点。最后，进行两次PCR反应，第一次PCR只有两端连接有不同接头的双链cDNA片段才得以指数扩增，而其他形式如一端有接头，而另一端无接头的只能线性扩增，没有引物结合点的不能扩增，还有两端为同一接头的形成袢状而无法获得指数扩增。利用巢式引物进行第二次PCR，富集差异表达的基因片段。PCR产物可以被直接插入T载体，或者利用接头1上的NotI/SmaI/XmaI位点和接头2R上的EagI位点进行定向克隆，或者接头与cDNA连接处的RsaI位点平端克隆。然后利用测序和杂交分析来分析差异表达的序列，或者用PCR产物作探针来筛选DNA文库。1.2抑制性消减杂交技术的优点在分离、克隆差异表达的基因序列片段中，抑制性消减杂交技术具有独特的优点。虽然基因芯片技术在差异表达基因谱分析中也非常有用，但是，所进行筛选的基因片断的种类是人为限制的。因为基因芯片制备过程中基因的种类和数量就已经决定了检测结果的范围。但是抑制性消减杂交技术的研究目的和可能得到的结果则不受预先设置条件的限制。换句话说，抑制性消减杂交技术更适合差异表达的新基因的克隆化。此外还有以下一些特点：(1)在分离稀少基因方面具有优势：cDNA消减杂交、代表性差异分析、mRNA差异显示方法都不能分离到低丰度的差异表达基因。而抑制消减杂交技术对高、低丰度的差异表达基因都能有效分离。这一重要优点主要归功于均等(normalization)过程，实验证明经过一轮消减可对稀少转录物富集达1000-5000倍(JiWetal.，2002)。(2)效率高：一次SSH反应可同时分离到几十到几百个差异表达的基因。(3)简便易行：抑制性消减杂交技术所采用的方法简单、成熟、易掌握、易操作。(4)假阳性率低：采用两次消减杂交和两次PCR，保证该方法有较高特异性。具相关报道证明抑制性消减杂交方法假阳性率可降至6%。(5)筛选周期短：应用这种方法一般3-4d即可获得差异表达基因片段的cDNA。2抑制性消减杂交技术在昆虫滞育中的应用昆虫借助遗传过程中包含的形态、行为、生理、生化特征去适应千变万化的环境。滞育就是昆虫适应各种环境这一过程中的重要特征，是昆虫在特定环境刺激下发生的一系列生理变化，出现低代谢，低速发育甚至不发育、又可在其他特定刺激后继续发育的一种遗传现象，是昆虫对环境适应性的一种表现，也是实现昆虫发育进度要求与环境同步的季节性的重要策略之一。随着安全意识和生态环保意识的增强，人们越发重视生物防治，利用滞育技术可显著延长天敌昆虫的产品货架期，调控天敌产品的释放时间，使其与害虫的发生时间相吻合，提高防治效益，这也是人们研究滞育机制的根本出发点。2.1抑制性消减杂交技术在鞘翅目滞育中的应用随着基因测序技术的不断提高和创新，不断有模式昆虫的全基因组被测出。此时利用抑制性消减杂交技术来寻找滞育相关基因是一种很好的途径，鞘翅目的模式昆虫赤拟谷盗Triboliumcastaneum的全基因组已测出，为鞘翅目昆虫的滞育相关基因研究提供了更好的蓝图与基础(Binzeretal.，2014)。Yocum等(2003)利用抑制性消减技术分离和鉴定了3个马铃薯甲虫Leptinotarsadecemlineata成虫滞育相关基因片段DAT－1，DAT－2和DAT－3。DAT－1和DAT－2在滞育诱导第三天即可微量检测到，而到第六天检测显示表达显著，其中DAT－1全长基因具有富含亮氨酸的结构域，DAT－2与黄粉虫Tenebriomolitor抗干燥蛋白基因有40%的相似度，序列分析认为它是干燥蛋白，干燥蛋白对昆虫进入滞育是非常重要的，通常情况下滞育昆虫的含水量低于非滞育昆虫，这是因为脂质的积累和代谢变化有利于昆虫的存活(Danks，2000)。2.2抑制性消减杂交技术在鳞翅目昆虫滞育中的应用鳞翅目模式昆虫家蚕的全基因组于2008年测出，这为鳞翅目昆虫的分子研究提供了丰富的基因信息资源库(Cheng，2014)。目前抑制性消减杂交技术应用于研究鳞翅目昆虫滞育的种类达到了4种。杨杰(2014)构建梨小食心虫Grapholitamolesta幼虫滞育差异表达文库与非滞育差异表达文库，分别获得42个和46个不同的非重复序列，发现在滞育个体中代谢酶和滞育关联蛋白基因表达量较高;而在非滞育个体中贮藏蛋白和信号传递基因表达量则较高，并克隆了梨小食心虫微管蛋白和肌动蛋白两个持家基因，由于这两个基因在滞育期间和非滞育期都能稳定表达，认为这两个基因均可作为梨小食心虫持家基因用于SSH文库的检测基因。Sasibhushan等(2012)建立滞育与非滞育家蚕卵的抑制性消减杂交文库，得到六种不同功能的特异表达基因，通过qPCR发现Hsc70蛋白(heatshockcognate，HSC)在滞育卵中上调。2.3抑制性消减杂交技术在双翅目昆虫滞育中的应用抑制性消减杂交技术应用于双翅目昆虫较多，由于双翅目昆虫的基因组数目较少，遗传背景比较简单，已进行全基因组测序的种类最多，为研究者提供了宝贵丰富的基因组资源，有利于研究者进行深层次、多角度、宽广度的分子研究。在Rinehart等(2010)人通过构建麻蝇的滞育与非滞育抑制性消减文库中，分离的97单克隆在Northern杂交中用作探针检测他们在滞育时的表达，其中17个基因上调，1个下调，12个基因表达不受滞育影响。上调基因主要分为热激蛋白、重金属反应、神经肽、结构、调控因子和其它不知功能的基因。这项研究有助于描述麻蝇的滞育转录组和有助于联系其它类群鉴定出共有的滞育相关因子。2.4抑制性消减杂交技术在直翅目昆虫滞育中的应用Reynolds等(2009)对直翅目的蟋蟀Allonemobiussocius滞育幼虫和越冬幼虫构建的抑制性消减杂交文库和实时荧光定量分析显示出8个差异表达基因，包括在滞育前期上调、滞育后期下调表达的