昊鑫生物EASYspinPlus组织细胞RNA快速提取试剂盒使用说明书

-1-昊鑫生物EASYspinPlus组织/细胞RNA快速提取试剂盒目录号：RN28目录编号包装单位RN280120次RN280250次适用范围：适用于快速提取动物细胞和易裂解动物组织总RNA，使用独有基因组DNA清除柱技术确保有效清除gDNA残留，不需要使用DNase消化，RNA可直接用于PCR，荧光定量PCR.。试剂盒组成、储存、稳定性：试剂盒组成保存20次50次裂解液RLTPlus室温20ml50ml去蛋白液RW1室温15ml40ml漂洗液RW室温5ml10ml第一次使用前按说明加指定量乙醇RNase-freeH2O室温10ml10ml70%乙醇室温4mlRNase-freeH2O9mlRNase-freeH2O第一次使用前按说明加指定量乙醇基因组DNA清除柱和收集管室温20套50套RNase-free吸附柱RA和收集管室温20套50套本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。◆TRIpureReagent抽提指南◆目录号RP02◆使用手册◆实验室使用，仅用于体外◆TRIpureReagent抽提指南◆目录号RP02◆使用手册◆实验室使用，仅用于体外◆TRIpureReagent抽提指南◆目录号RP02◆使用手册◆实验室使用，仅用于体外-2-储存事项：1.所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。2.不合适的储存于低温（4℃或者－20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃－25℃）进行。3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。产品介绍：本公司独家推出EASYspin无苯酚、氯仿RNA快速提取技术基础上，又独家研发成功基因组DNA清除柱技术确保有效清除gDNA残留，得到的RNA不需要DNase消化，可直接用于PCR、荧光定量PCR等实验。独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，然后裂解混合物通过一个基因组DNA清除柱，基因组DNA被清除而RNA穿透滤过。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后,RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤,去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的RNasefreeH20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。产品特点：1.完全不使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。2.快速，简捷，单个样品操作一般可在30分钟内完成。3.独家研发成功基因组DNA清除柱技术确保有效清除gDNA残留，得到的RNA不需要DNase消化，可直接用于PCR、荧光定量PCR等实验。4.多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达2.1-2.2（100%纯的RNA比值一般是2.2左右，很多公司无法达到这个标准，所以1.9-2.0就凑合用了，但是我-3-们的产品标准一般可以达到2.1-2.2），基本无DNA残留,可用于RT-PCR，Northern-blot和各种实验。注意事项1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf5415C或者类似离心机。2.样品处理量绝对不要超过基因组吸附柱DA和和RNA吸附柱RA处理能力，否则造成DNA残留或者产量降低。不同组织细胞种类RNA/DNA相差极大，例如胸腺脾脏DNA含量丰富，超过5mg就会超过柱子处理能力。COS细胞RNA含量丰富，超过3x106细胞就会超过柱子吸附能力。所以开始摸索实验条件时，如果不清楚样品DNA/RNA含量时宁可使用较少的样品处理量，如细胞不超过3-4x106，组织不超过10mg。将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。3.裂解液RLTPlus和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。4.预防RNase污染，应注意以下几方面：1)经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。2)使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。3)RNA在裂解液RLTPlus中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。4)配制溶液应使用无RNase的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%(v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌。）5.关于DNA的微量残留：一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留-4-（DNase消化也无法做到100%无残留），本公司的EASYspinPlusRNA提取产品，由于采取了本公司独特的缓冲体系和基因组DNA清除柱技术，绝大多数DNA已经被清除，不需要DNase消化，可直接用于反转录PCR和荧光定量PCR。个别特殊情况如DNA含量过于丰富造成残留或者要进行严格的mRNA表达量分析荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：1)选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接区,这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。2)选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。3)将RNA提取物用RNase-free的DNaseI处理以提高效果。本试剂盒还可以用于DNaseI处理后的RNA清洁(cleanup),请联系我们索取具体操作说明书。4)在步骤去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上进行DNaseI处理。请联系我们索取具体操作说明书。6.RNA纯度及浓度检测：完整性：RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5kb和2kb，分别相当于28S和18SrRNA。动物RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。纯度：OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的参考指标。高质量的RNA，OD260/OD280读数（10mMTris,pH7.5）在2.1-2.2之间（100%纯的RNA比值一般是2.2左右，很多公司无法达到这个标准，所以1.9-2.0就凑合用了，但是我们的产品标准一般可以达到2.1-2.2）。OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10mMTris，pH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数1.8-2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯。-5-浓度：取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260,OD280测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μl）=(OD260)×(稀释倍数n)×40。操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）提示：第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇!1.组织培养细胞a.收集107悬浮细胞到一个1.5ml离心管，对于贴壁细胞，孔板培养可以直接裂解，细胞瓶培养应该先用胰蛋白酶消化后吹打下来收集。b.13，000rpm离心10秒（或者300g离心5分钟），使细胞沉淀下来。完全吸弃上清，留下细胞团，注意不完全弃上清会稀释裂解液导致产量纯度降低。c.轻弹管壁将细胞沉淀完全松散重悬，加350μl（5x106细胞）或600μl（5x106-1x107细胞）裂解液RLTPlus，吹打混匀后用手剧烈振荡20秒充分裂解。d.匀浆：（处理细胞量极少时1x105一般不需要，涡旋振荡一分钟匀浆）。用带钝针头的一次性1ml(配0.9mm针头)注射器剧烈抽打裂解物10次以上或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度防堵塞柱子和提高产量。e.将裂解混合物或匀浆混合物全部加到DNA清除柱上（清除柱放在收集管内）。f.立刻接操作步骤项下3。2.动物组织（例如鼠肝脑）a.电动匀浆：新鲜组织用解剖刀迅速切成小碎块,加入350μl(20mg组织)或者600μl(20-30mg组织)的裂解液RLTPlus后电动彻底匀浆20-40秒。b.液氮研磨+匀浆：在液氮中研磨组织成细粉后，取适量组织细粉(20mg/30mg)转入装有350μl/600μl组织裂解液RLTPlus的1.5ml离心管中,用手剧烈振荡20-6-秒，充分裂解。用带钝针头的一次性1ml(配0.9mm针头)注射器剧烈抽打裂解物10次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度防堵塞柱子和提高产量。c.将匀浆后裂解物13，000rpm离心3分钟,沉淀可能存在的裂解困难的碎片或者不溶物,将裂解物上清全部加到DNA清除柱上（清除柱放在收集管内）。d.立刻接操作步骤项下3。3.立刻13,000rpm离心60秒，保留滤过液（RNA在滤过液中）。确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。4.用微量移液器较精确估计滤过液体积（通常为350μl/600μl，滤过时候损失体积应该减去）,加入等体积的70%乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇!）,此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。5.立刻将混合物(每次小于700μl,多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm离心30秒，弃掉废液。6.加700μl去蛋白液RW1，室温放置1分钟，12，000rpm离心30秒，弃掉废液。7.加入500μl漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm离心30秒，弃掉废液。加入500μl漂洗液RW,重复一遍。8.将吸附柱RA放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。9.取出吸附柱RA，放入一个RNasefree离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μlRNasefreewater（事先在70-90℃水浴中加热可提高产量），室温放置1分钟，12,000rpm离心1分钟。10.如果预期RNA产量30μg,加30-50μlRNasefreewater重复步骤9,合并两次洗脱液,或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。-7-洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%,但是浓度要低,用户根据需要选择。使用该产品发表的部分文章:1.EngagementofSolubleResistance-RelatedCalciumBindingProtein(sorcin)withfoot-and-mouthdiseasevirus(FMDV)VP1inhibitstypeIinterferonresponseincells.Availableonline21May20132.Overexpressionofsmallheatshockprotein21protectstheChineseoak4silkwormAntheraeapernyiagainstthermalstress.JournalofInsectPhysiology,IP3099No.ofPages7,Model5G14June20133.S-Adenosylmethionine-inducedadipogenesisisaccompaniedbysuppressionofWnt/b-cateninandHedgehogsignalingpathways.MolCellBiochem(2013)382:59–73,DOI10.1007/s11010-013-1718-34.Acriticalroleo