普本的工艺大实验指导书

1β-胡萝卜素发酵实验指导书（70升）一、实验目的1.了解和掌握微生物代谢产物发酵生产的一般工艺流程和方法。2.掌握发酵罐的操作使用方法。3.了解和掌握β-胡萝卜素发酵生产的基本方法和步骤。二、实验原理发酵主要是指利用微生物的新陈代谢作用来生产各种代谢产物或菌体的过程。发酵根据发酵培养基物理状态的不同可分为固态发酵和液态发酵两大类，根据发酵过程中是否需要氧气可分为有氧发酵和厌氧发酵。根据发酵规模大小的不同可分为三角瓶发酵、小型发酵罐发酵（实验室5~200升）和大型发酵罐发酵（工业化大规模）。发酵生产的一般工艺流程如下：一套完备的发酵设备通常由发酵罐、控制器、蒸汽发生器和空压机及空气过滤器等几部分组成，其中发酵罐通常又由罐体、换热器（夹套、蛇管）、检测装置（pH电极、溶氧电极、泡沫电极）和搅拌器等几部分组成。β-胡萝卜素是一种广泛存在于绿色植物和黄色蔬果中的天然类胡萝卜素，属四萜类碳氢化合物，分子式为C40H56，分子量536.88。分子中含有2个β-紫罗酮环和由4个异戊二烯首尾相连而成的中心骨架，整个分子是对称的，有多个双键且双键之间共轭。β-胡萝卜素主要有全反式、9-顺式、13-顺式及15-顺式四种形式。全反式β-胡萝卜素分子结构保藏菌种菌种活化种子扩大培养发酵罐发酵固液分离初步纯化高度纯化成品化2天然β-胡萝卜素是一种天然优质色素，除用于食品着色剂之外，主要还有以下几种应用：（1）是比SOD和维生素E更为有效的生理抗氧化剂和自由基清除猝灭剂，是人类用于防老抗衰、防癌、抗癌和预防心血管疾病的良好手段；（2）是人类维生素A的主要来源，被用于治疗由于维生素A缺乏引起的各种疾病；（3）具有很强的抗辐射作用，能明显减轻或很快消除放疗引起的恶心、呕吐、乏力等副作用，被推荐为放射疗法治疗癌症的首选辅助药物；（4）能有效增强免疫机能，促进生长发育，增强体质和焕发青春活力的不可多得的保护性营养素；（5）是良好的饲料添加剂，能促进畜禽生长，并明显提高家畜产仔率和家禽产蛋量。β-胡萝卜素的制取方法主要有天然物萃取法、化学合成法和发酵法三种。天然物萃取法因原料中β-胡萝卜素含量太低而导致生产成本较高。化学合成法成本低，产品纯度高，但合成β-胡萝卜素生理功能差，高剂量时自身还有明显的毒性。发酵法因产量高，成本相对（天然物萃取法）较低而成为一种较为理想的天然β-胡萝卜素生产方法。三孢布拉氏霉是目前国内外研究和生产β-胡萝卜素的主要微生物，属异宗结合菌，有正、负两种单性菌株，可独立无性繁殖形成孢囊孢子，也可异宗配合进行有性繁殖，形成接合孢子。三孢布拉霉具有分解蛋白质和淀粉的能力，生长后期可大量产生β-胡萝卜素于管状细胞中，使菌体呈黄色至橙红色。三孢布拉霉与其它菌种相比具有生物量大，单位菌体量中β-胡萝卜素含量高等优点，是工业化生产天然β-胡萝卜素的理想微生物。三、试剂与器材1.试剂（1）葡萄糖；（2）麸皮；（3）植物油；（4）β-紫罗兰酮；（5）KH2PO4；（6）MgSO4；（7）VB1；（8）NaOH；（9）新鲜土豆；（10）石油醚（沸程60~90）；（11）酒精；（12）无水Na2SO3；（13）标准缓冲溶液；（14）消泡剂。2.器材（1）500ml三角瓶；（2）1000ml、500ml、100ml烧杯；（3）恒温振荡培养器（摇床）；（4）100升全自动发酵罐；（5）真空干燥箱；（6）气流式超微粉碎机；（7）分光光度计；（8）纱布。3.菌种3三孢布拉霉正菌；三孢布拉霉负菌。4.培养基（1）斜面和平板培养基（PDA培养基）马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15~20g，自来水1000ml，自然pH。制法：新鲜马铃薯去皮后，切成小块，加水煮沸20分钟，用4层纱布过滤，取滤液再加糖和琼脂，加热融化后补足水分，121℃灭菌20min。（2）三角瓶种子培养基5%葡萄糖，1.7%麸皮，自然pH。121℃灭菌20min。（3）发酵培养基8%葡萄糖，5.0%麸皮（煮出液），1.0%（v/v）大豆油，0.1%KH2PO4，0.05%MgSO4，0.01%VB1，0.1%β-紫罗兰酮，0.1%消泡剂。制法：根据发酵培养基总体积70升称取麸皮3500g，加自来水约20升，煮沸60min，单层纱布过滤，取滤液再加入葡萄糖、大豆油、KH2PO4、MgSO4、VB1和消泡剂，溶解后加自来水补足水分（应考虑发酵培养基在发酵罐中直接通蒸汽进行灭菌时，蒸汽会产生冷凝水导致发酵液体积增加，因此灭菌前发酵液体积应比70升小一些）。四、操作步骤1.实验总流程：2.菌种活化：取沙土管保藏的正、负菌种分别接种至新鲜的PDA平板培养基，28℃培养4天。3.种子培养：将平板活化的正、负菌种分别接种至三角瓶种子培养基中，在28℃、200rpm的摇床中摇瓶培养32h。4.发酵培养基灭菌：盖紧罐盖上各种盖帽，旋紧罐盖上压紧螺栓。校正pH电极和溶氧电极的零点，将电极装入罐体。将配制好的发酵培养基加入发酵罐中，调pH7.0。打开发酵罐排气阀，通蒸汽进发酵罐夹套进行加热，打开搅拌器进行适当搅拌以提高传热效率。当温度升至80~90℃时，关掉搅拌器，微开夹套蒸汽阀。通蒸汽进空气过滤器，缓慢开切断阀，蒸汽经空气过滤器进入发酵罐培养基中，调节蒸汽进汽阀和切断阀（必须保证切断阀有一定的开沙土管保藏菌种平板活化三角瓶种子培养发酵罐发酵菌丝体收集真空干燥菌丝粉碎含量检测4度，不得关死），使空气过滤器的蒸汽压力维持在0.12~0.16Mpa。当发酵培养基加热至沸腾，排气口排出白色水蒸气约3min后关闭排气阀（不要完全关死，让少量蒸汽维持外排）。打开发酵罐底部蒸汽阀，将蒸汽直接通入发酵罐中，调节发酵罐底部蒸汽阀，维持罐中压力0.1Mpa灭菌20min。灭菌完后，先关闭发酵罐的排气阀，再关闭发酵罐底阀，开取样阀，让蒸汽从取样阀排出，对取样阀进行灭菌。关闭切断阀，再关闭空气过滤器前的蒸汽阀，打开空气阀，再打开空气过滤器后的冷凝水阀，用空气吹干空气过滤器。关闭发酵罐夹套蒸汽阀。待发酵罐自然冷却至0.05Mpa时，关空气过滤器后冷凝水阀，缓慢开空气切断阀，让空气进入发酵罐中，保持发酵罐的压力（以避免发酵罐压力降得太低，产生倒吸，导致发酵罐染菌）。打开发酵罐夹套进水阀和循环管线切断阀，将控制器中温度控制设定方式为“自动”，并设定发酵温度，发酵罐进入自动降温。当罐温降至100℃时，可适当进行搅拌，以提高传热效率。当温度稳定至发酵温度时，调节空气流量为1.0vvm，罐压保持在0.03~0.04Mpa。5.接种：打开发酵罐顶部的加料口盖，酒精火焰封口，先用灭菌的NaOH溶液将发酵培养基调至pH7.0（灭菌过程中培养基的pH值会下降），再将摇床培养好的三角瓶液体种子——正、负菌种分别接入发酵培养基中，正菌200ml，负菌1000ml。10min后校正溶氧电极的100%点。6.观察记录：接种后每隔2h观察罐中菌丝生长和色素形成情况，并记录温度、pH值和DO等工艺参数值。7.补料：接种40h后，补加0.1%的β-紫罗兰酮（已灭菌），以促进β-胡萝卜素的合成。8.放罐：发酵136h（五天半）后，停止发酵，放出发酵液。单层纱布过滤，收集菌丝体，自来水冲洗菌丝体至滤过液无色为止。9.干燥：挤干菌丝水分，将菌丝团分散，至于真空干燥箱中55℃真空干燥30h，称取干菌体重量，计算生物量。10.粉碎：将干菌丝体用气流式超微粉碎机进行粉碎，收集菌粉。11.β-胡萝卜素含量测定：电子天平称取0.01g的干菌粉置于100ml干烧杯中，加入50ml石油醚，保鲜膜封口，室温下浸泡萃取2h，静置澄清，取上面澄清液在450nm波长下测其吸光度（用纯石油醚调零点），根据标准曲线计算出萃取液中β-胡萝卜素的浓度，再根据萃取液的总体积和称取的菌粉的质量计算出每克的干菌体中所含有的β-胡萝卜素的质量。五、实验结果1.计算出发酵液中的生物量（g干菌体/L发酵液）。2.计算出干菌体中β-胡萝卜素的含量（mgβ-胡萝卜素/g干菌体）。3.计算出β-胡萝卜素发酵的体积产量（mgβ-胡萝卜素/L发酵液）。六、思考题51.可合成β-胡萝卜素的微生物有哪些？现在为什么多采用三孢布拉霉进行发酵生产？2.用三孢布拉霉发酵生产β-胡萝卜素的过程中添加β-紫罗兰酮起什么作用？