浓香型大曲中酯化酶测定方法的研究

酿酒HQUORMAKINGV01．30．No．2Mar．，2OO3文章编号：1002—8110(2003)02—0018一o4浓香型大曲中酯化酶测定方法的研究王耀，范文来，徐岩2，刁亚琴，陆红珍(1．江苏洋河集团有限公司，江苏宿迁223725；2．江南大学生物i程学院，江苏无锡214036)摘要：对浓香型大曲的酯化酶测定方法作了研究。建立有机相反应体系来代替传统方法的水相反应，与传统测定方法(需反应100h)相比，它能简单、快捷检测大曲质量，适合工业化生产的要求。有机相中酯化反应条件为：在30mL正庚烷有机反应介质中，35的条件下，0．15M的底物酸，己酸与乙醇的浓度比为1：1．25，加入15g(干曲)的大曲，仅用24h就能比较出大曲酯化力的高低。关键词：浓香型，大曲，酯化酶，酯化，测定方法中图分类号：TS262．31；TQ925文献标识码：A‘0前言酯酶(EaemseE．C．3．1．1．2)亦称羧基酯酶，是指可以水解羧酯键的酶【lI4J。但该酶也能催化合成低级脂肪酸酯LlJ。由于该酶既能催化酯的合成，也能催化酯的分解，因此，白酒业习惯分别称为酯化酶和酯分解酶[5-7J。酵母、霉菌、细菌中均含有酯酶[，6．。目前已经发现，红曲霉、根霉中许多菌株有较强的己酸乙酯合成能力【5'。酯酶不同于脂肪酶。脂肪酶(缉磁e，E．C．3，1．1，3)是一类特殊的酯酶，全称Tr／acy／g／ycerdacy／hydro／aseo脂肪酶的正式名称是甘油酯水解酶。它既能将脂肪水解为脂肪酸和甘油，又能催化脂肪的合成【5．9J。按NovoNordisk公司的定义，脂肪酶是可以水解一类特殊的酯类——三羧酸甘油酯的酶，而酯酶则是可以水解羧酯键的酶【111。对大曲酯化力的研究开始于20世纪8o年代后期[12,13J，但广泛和深入的阐述大曲对浓香型酒生香的作用却是在20世纪90年代[一·M一刮。传统的酯化力测定方法【6J，是利用皂化反应和反滴定法来测定。此法测定时间长，操作复杂。本文研究了利用有机相代替水相的酯化酶活力的测定。0．1传统酯化力的测定【6J6先用碱中和酯化液中的游离酸，再加入一定量的碱使酯皂化，过量的碱用酸进行反滴定，用酚酞作为指示剂。其反应式为：RC00H+NaOH—÷RC00Na+ROH2NaOH+Sq—一Na2S04+2H200，2优化后酯化力测定方法的原理近年来，酶在有机相中的生物催化作用因其潜在的工业用途而日益受到人们的重视[117,18】。与水相催化相比，有机介质可以增加酯酶的热稳定性，增加非极性底物的溶解度，减少反应副产物，还可能影响酶的底物特异性及酶反应的平收稿日期：2o03—01—16衡方向和反应速度。有机溶剂相中酯化反应平衡点与速率同溶剂中水含量密切相关，有机溶剂作为反应介质时，在一个狭窄的初始含水量范围内，酶有较高的催化酯化活力。当初始加水量较低时，酶分子由于不能获得形成活力构象所必需的水，表现出较低的催化反应活力；当体系中水初始含量高时，从物理状态来看，在反应的初始阶段酶粉即发生粘结，产生吸附现象，无法均匀分散，故反应速率也降低。对本研究而言，所加入的酶不是纯酯化酶，而是加入一定量的带水分的大曲，大曲含水量在12％左右，此时反应体系中的含水百分比约为6％左右，这虽然高于一般反应介质的最佳含水量【181，但仍处于微水范围。而且，反应所利用的酯化酶是从大曲颗粒里浸出来的，酶量很少，加上曲粉的间隔作用，这样的含水量是不会发生酶粘结现象的，因此采用无水有机溶剂与试剂进行酯化力的测定方法是可行的。现以正庚烷为有机溶剂来代替水相进行酯化力测定方法的优化，以期在尽可能短的时间内鉴别出大曲酯化能力的高低。由于大曲的酯化反应是可逆反应，因此不仅要优化条件以确保酯化能力最强，同时还要确保在此条件下分解能力最差，只有酯剩余量多的条件才是最适条件。1试验材料1．1大曲1．1．1粉碎用微型植物粉碎机粉碎。筛孔~'lmm。1．1．2分样采用四分法。通常样品需要量500引。1．1，3大曲样品分类方法见参考文献[23】。1．2试剂1．2．1正庚烷，AR级，每瓶试剂(500ⅡlL)加入3og无水硫酸钠。1．2，2己酸，AR级，每瓶试剂(500ⅡlL)加入30g无水硫酸钠。1．2．3无水乙醇，AR级，每瓶试剂()加入30g无水硫酸钠。1．2．4pH4，6醋酸一醋酸钠缓冲液，配制方法见参考文献【6J。维普资讯期王耀，等：浓香型大曲中酯化酶测定方法的研究·l9·1．2．5100m~100mL己酸乙酯的20％(v／v)乙醇溶液，配制方法见参考文献。1．3仪器恒温培养箱：上海恒三仪器厂。2测定方法2．1传统酯化力的测定方法具体见文献【6J。2．2优化后酯化力测定方法影响己酸乙酯合成反应的因素有很多，做单因素分析实验，对加入底物酸(己酸)与乙醇的浓度、加曲量和反应温度等进行优化。每间隔一段反应时间，取出上清液0．2mL于50mL三角瓶中，加入5mL水，1滴酚酞，用O．025MNaOH滴定至酚酞终点，记下消耗的毫升数。计算公式为：降酸％=(Vl—Vo)×100％vo式中：v0一反应前消耗NaOH的体积(mL)vl——反应一段时间后消耗NaOH的体积(mL)3结果与讨论3．1酯化力3．1．1传统方法测定酯化力传统方法采用100mL1％的己酸、乙醇溶液，加相当于5g干曲的曲量，在30—32℃酯化100h，用NaOH皂化己酸乙酯来求得己酸乙酯量。下面对1、2曲及陈曲的酯化力进行测量，以便进行优化的研究(表2)。表2传统方法测定酯化力(三次平均)从表2可以看出，大曲的质量越好，酯化力越高；贮存时间短的曲(三个月以上)，酯化力越大，但陈曲的酯化力不高。因此，仅从酯化力考虑，大曲的贮存时间也不可过长，否则，酯化力会大幅度下降。3．1．2优化方法的建立影响酶在有机溶剂中催化合成己酸乙酯反应的因素有．2】：第一，底物浓度比(酸、醇浓度比)。第二，加酶量。加酶量有一个临界值，当加酶量小于临界值时，会影响反应平衡转化率；当加酶量超过临界值后，平衡转化率不再发生变化，而反应速度随着酶量的增加而加快。第三，底物的浓度、尤其是有着较强极性的己酸浓度，直接关系着酶的催化活性和稳定性。第四，反应温度。它既关系着酶的活性，也关系着反应速度。第五，有机相中，酶的催化活性与反应系统的含水量密切相关，只有最适含水量时，酶最稳定，且表现出最大活力。3．1．2．1底物酸与醇的比例对酯化反应的影响理论上，己酸与乙醇反应的摩尔比为1：1，为使反应向己酸乙酯方向顺利进行，醇应略过量。设定乙醇的三个梯度。定量：正庚烷30mL，己酸0．15tool，绝干曲量5g，温度30℃，在100mL磨口三角瓶中反应。变量(摩尔比)：己酸：乙醇=1：1．15(样品一)己酸：乙醇=1：1．25(样品二)己酸：乙醇=1：1．35(样品三)螽逝050100150h+样一+样二+样三图1底物酸与醇比例对鸶化的影响由图1知：样品二的降酸幅度大于样品一和样品三，说明样品二比样品一、样品三早达到平衡点，所以取底物酸与醇比例为1：1．25。3．1．2．2加曲量对酯反应的影响定量：正庚烷30mL，己酸-乙醇=1：1．25，己酸浓度0．15mol，温度30℃，在100mL磨口三角瓶中反应。变量：加曲量分别为5g、10g、15g(若加入20g大曲则会没有溶剂剩余)。由图2可知：最佳加曲量为15g。蕊世反应时间(x10)图2加曲量对酯化的影响3．1．2．3底物酸浓度对酯化反应的影响资料表明【培J，当基质中己酸含量在50×10一以下时，己酸乙酯按比例增加，在(50—70)×10I6之间，己酸乙酯虽有增加，但升幅较大。3．1．2．3．1设定己酸浓度梯度为0．1—1．0mol，确定最佳底物酸浓度。定量：正庚烷30mL，己酸：乙醇=1：1．25，干曲量15g，温度30℃，在100mL磨口三角瓶中反应。变量：己酸浓度分别为0．1n、0．2mol、0．4mol、0．6mol、0．8mol、1．0mol。图3说明底物酸浓度太高时，便抑制反应向己酸乙酯方向进行，0．1mol浓度时降酸最快。3．1．2．3．2设定己酸浓度在0．1—0．2tool之间。定量：同上。变量：己酸浓度分别为0．1tool、0．125mol、0．15mol、0．175mol，作图4。∞牾柏∞衢∞坫加5O维普资讯·20·酿酒605040鑫。。澄20100螽澄050100h己酸降酸曲线圈3己酸浓度对酯化的影响—●一0．1M．-II-0．+0．4M*0．6M0．8M+1．oM圈4底物酸浓度对酯化的影响由图4可以看出0．1mol与0．2mol间的降酸曲线斜率差距不大。0．15tool的降酸稍微快一点，所以优化后所得的己酸浓度为0．15tool。3．1．2．4温度对酯化反应的影响资料表明，在低温25—30℃时，生成总酯量高。随着温度上升，总酯量明显下降。酿造过程中，曲霉与酵母对己酸都有不同程度酯化能力。当酵母与曲霉两者共同作用时，则己酸乙酯量大增。产酯酵母主要是球拟酵母，35℃时产酯量最高，曲霉作用温度也在35℃左右。于是作三个温度梯度，以期找到最佳温度。定量：正庚烷30mL，己酸：乙醇=1-1．25，己酸浓度0．15M，干曲量15g，在100mL磨121三角瓶中反应。变量：酯化反应温度为25℃、30℃、35℃。如图5。050100h圈5温度对酯化反应的影响+25℃+30℃+35℃由图5可以看出，35℃时反应最快，因此选用的酯化反应的温度为35℃。3．1．2．5酯化反应最佳条件综上所述，优化后最终的酯化反应条件为：在30mL正庚烷有机反应介质中，加入底物酸与乙醇，底物酸的浓度为0．15mol，己酸与乙醇的浓度比为l：1．25，加入大曲15g，在100mL的磨口三角瓶中，35℃的条件下反应。3．1．3优化后的方法与传统方法对比优化以后的测定与传统方法相比具有很大优点，主要体现在以下几个方面(见表3)表3优化前后方法的对比优化前的方法优化后的方法反应介质测酯方法方法简易度反应时间测定结果水相有机溶剂相用碱皂化。直接测定测定降酸量，间接测定经蒸馏、皂化、滴定，复杂只用滴定，简单100h24h两者相同从表3可以看出优化后测定方法的优势所在。两种方法时间上的明显差距，使得优化后的方法更加适用于实际生产中的测定。4结论4．1传统酯化力测定方法操作复杂，耗时长。采用在有机相中反应的方法来测定大曲的酯化力，则相对比较简单，且检测时间可以缩短至24h，有利于大生产中快速检测。4．2优化最佳测定条件为：在30mL正庚烷有机反应介质中，加入己酸与乙醇，己酸的浓度为0．15tool，己酸与乙醇的浓度比为1：1．25，加入大曲粉15g，在100mL的磨口三角瓶中，35℃的条件下反应24h，测定降酸量。【参考文献】[1]无锡轻工业学院，等．生物化学(工业发酵专业用)[M]．轻工业出版社。1980，11．‘[2]DesnuelleP，Adv．B1[J]．，1961，223：129—159．[3]Ve~-erR．。Meth．E~ymolEJ]．，1980，64：340—392．Ea]B．施特尔马赫．酶的测定方法[M]．中国轻工业部出版社。1992．[5]范文来，徐岩．大曲酶系研究的回顾与展望[J]．酿酒，2000，(3)．[6]沈怡方．白酒生产技术全书[M]．中国轻工业出版社，1998，10．[7]胡晓，等，脂酶的酯化反应特性及其在酿酒工业中的应用[J]．酿酒科技，1997，(5)：13—16．[8]吴衍庸，泸型红曲霉增香在浓香型酒上应用研究进展[J]．酿酒科技。1999，(1)：18—20．[9]谢红想，有机相中芳香酯合成用脂肪酶产生菌的筛选及其应用[C]．硕士学位论文．[10]徐岩，无锡轻工大学博士论文Ec]．1997．[11]T．Nielsen，IndustrialApplicationPossibilitiesforLipase[C]．Lectureattl39DEF—Meetinginn~el-，27Sep1983．[12]周恒刚，等，