浙江大学生物化学实验甲用正交法测定几种因素对蔗糖酶活性的影响

用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响1、正交法简介•在生产实践中,试制新产品、改革新工艺、寻求好的生产条件等,都需要先做试验。•试验总要花费时间，消耗人力、物力、因此人们总希望做实验的次数尽量少，而得到的结果尽可能地好。•要达到这个目的，就必须事先对实验作合理的安排，也就是要进行试验设计。•实际问题是复杂的，对实验有影响的因素往往是多方面的。用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响•我们常常需要考察各因素对实验影响的情况，但在多因素、多水平试验中，如果对每个因素的每个水平都互相搭配进行全面试验，需要做的试验次数就会很多。•比如对两个7水平的因素，如果两因素的各个水平都互相搭配进行全面试验，要做72=49次试验，•而3个7水平的因素要进行全面试验，要做73=343次试验。•作这么多次试验，要花费大量的人力、物力，还要用相当长的时间，显然是非常困难的。用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响•有时，由于时间过长，条件改变，还会使试验失败。•人们在长期的实践中发现，要得到理想的结果，并不需要进行全面试验，即使因素个数、水平都不太多，也不必作全面试验。•我们总是希望在不影响试验结果的前提下，尽可能的减少试验次数，正交试验设计就是解决这个问题的有效方法。2、正交法的原理用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响•正交试验设计的主要工具是正交表。•正交试验设计是通过借助于正交表，简化表格计算，正确分析结果，从而找到试验的最佳条件，分清因素的主次，这样就可以通过比较少的试验次数达到好的试验效果。•实践证明，正交法是一种多、快、好、省的方法，目前已被广泛应用于工农业生产和科学试验中。•本试验运用正交法测定底物浓度、酶浓度、温度、pH值这四个因素对蔗糖酶活性的影响，并求得在什么样的底物浓度、酶浓度、温度和pH值时酶活力最大。用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响3、正交法的设计过程（以本试验为例）1、根据试验目的，确定要考核的试验指标。2、确定要考察的试验因素和各因素水平。•要通过对实际问题的具体分析选出主要因素，略去次要因素，这样可使因素的个数少些，从而减少试验次数和计算。•本试验取四个因素，即底物浓度[s]、酶浓度[E]、温度、pH值。每个因素选三个水平（水平即在因素的允许变化范围内，要进行试验的“点”）。试验因素和选用水平如表1所示。用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响•作因素、水平表时，各因素的水平最好不要按大小顺序排列。•如按一般方法，对四个因素三个水平的各种搭配都要考虑，共需做34=81次试验，而用正交表只需做9次试验。因素水平[s](ml)[E](ml)温度（℃）pH10.50.8503.620.20.5375.630.80.2654.6表1因素、水平表用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响3、选择合适的正交表•首先根据各因素的水平选择相应水平的正交表，同水平的正交表有好几个，究竟选哪一个要看因素的个数，•一般只要正交表中因素的个数比试验要考察的因素的个数稍大或相等就行了。这样既能保证达到试验目的，而试验的次数又不至于太多，省工省时。用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响•正交表的表示：正交表Ln（tq）•L：正交表的代号；n：处理数（试验次数）•t：水平数；q：因素数•试验次数n=q（t-1）+1•本试验选用四因素，每个因素选三个水平，因此可选用正交表L9（34）。4、在所选的正交表上进行表头设计•把因素放入正交表头的工作，叫做表头设计。用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响•如本试验是一项四因素各三水平的试验，因此表头设计时，可将四个因素依次放在L9（34）的第1，2，3，4列上。见表2所示。表2表头设计1233931238231372132613225321243331322212111114321水平因素试验号用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响•正交表都具有以下两个特性：a、在每一列中，各水平出现的次数相等，即在任何一列中，数字1、数字2和数字3都出现三次（几个水平就均出现几次）b、任何两列中，横行组成的数对出现的次数相等，均出现一次（这里有9个不同的数对，均出现一次），即（1，1）、（1，2）、（1，3）、（2，1）、（2，2）、（2，3）、（3，1）、（3，2）、（3，3）各出现一次。用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响•以上这些特点保证了用正交表安排的试验计划是均衡搭配的，因此分析数据比较方便，可进行综合比较，结果比较可靠。4、酶活力的测定原理还原糖+3，5-二硝基水杨酸糖酸+氨基化合物OH-△红棕色，540nm处具特征光吸收，OD540值与还原糖含量成正比，可据此进行比色测定。（DNS试剂）蔗糖葡萄糖+果糖蔗糖酶H2OCH2OHOHOOHOHHOCH2OHOHOOHHOCH2OH+用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响5、试验安排•先将本试验的四个因素依次填入L9表的因素1，2，3，4中，•再将各列的水平数用该列因素相应的水平写出来，便可得到如表3所示的试验安排表。•表中试验号共9个，表示要做9次试验，每次试验的条件如每一纵行所示。实验号试剂（ml）2491683575%蔗糖(ml)0.50.20.80.50.20.80.50.20.8乙酸缓冲液(ml)pH5.62pH4.62pH3.62pH3.61.7pH5.62.6pH4.61.7pH4.62.3pH3.62.3pH5.61.437℃预温2min50℃预温2min65℃预温2min蔗糖酶液(ml)（合适稀释倍数）0.50.80.20.80.20.50.20.50.8反应总体积3.0ml37℃反应10min50℃反应10min65℃反应10min表3试验安排表1、将各管混匀后,分别在各自温度下（37℃、50℃/55℃、65℃/75℃）保温10分钟。2、向各管中加入1.0ml3.5-二硝基水杨酸试剂（终止酶促反应，同时为显色剂），沸水中加热5分钟（显色反应），3、取出冷却后，再向每管中加入5ml蒸馏水，摇匀，测A540值。用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响•测定步骤：1、酶促反应管（No.1-9）•将各管溶液混匀后,分别在各自温度下（37℃、50℃/55℃、65℃/75℃）保温10分钟。•然后向各管中加入1.0ml3.5-二硝基水杨酸试剂（碱性终止酶促反应，同时为显色剂），沸水中加热5分钟（显色反应）。•取出后立即用冷水冷却至室温，再向各管中加入5ml蒸馏水，摇匀，测A540值。用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响•2、非酶对照管（调零用）•另取试管一支作非酶对照管（调零用），•先加入蔗糖酶溶液0.5ml，•再加入蒸馏水2.0ml，摇匀后沸水中加热10min让酶变性失活，•再加入5%蔗糖溶液0.5ml，65℃保温10分钟。•然后向管中加入1.0ml3.5-二硝基水杨酸试剂（碱性终止酶促反应，同时为显色剂），沸水中加热5分钟（显色反应）。•取出后立即用冷水冷却至室温，再向管中加入5ml蒸馏水，摇匀，测A540值。用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响6、试验结果及分析•试验做好后，把9个数据填入表4试验结果栏内，•按表中数据计算出各因素的一水平试验结果总和、二水平试验结果总和、三水平试验结果总和，再取平均值（各自被3除）。•最后计算极差。•极差是指同一列中，各水平平均值中的最大值与最小值之间的差。•一般地，各列的极差是不相同的，这说明各因素的水平改变对试验指标的影响是不同的。用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响•极差越大，说明这个因素的水平改变对试验指标的影响越大。•极差最大的那一列，表明那个因素的水平改变对试验指标的影响最大，那个因素就是我们要考虑的主要因素。•而在同一列各水平试验结果的平均值中（即某因素下各水平平均值中），值最大所对应的那个水平即为该因素的最适条件。•各因素最好的水平合在一起就是最好的试验条件，同时还要考虑因素的主次。用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响•对于主要因素，一定要按照有利于指标要求选取；•对于次要因素，则可以考虑实际试验条件（如成本、试验条件等）来选取适当水平，而得到符合试验实际的最优或较优试验条件。这一过程就称为直观分析法。见表4。•最后以A（Ⅰ/3，Ⅱ/3，Ⅲ/3）值为纵坐标，因素的水平数为横坐标作图（注意：作图时，水平数应从小到大排列），并通过各图确定最适的酶促反应条件。0表4试验结果分析计算表水平因素试验号1[s](ml)2[E](ml)3温度(℃)4pH值试验结果A54010.510.815013.610.520.523725.610.530.236534.620.210.823734.620.220.536513.620.230.215025.630.810.836525.630.820.515034.630.830.223713.6Ⅰ(一水平试验结果总和)Ⅱ(二水平试验结果总和)Ⅲ(三水平试验结果总和Ⅰ/3Ⅱ/3Ⅲ/3级差