朱国华博士大论文完整版标红版本

分类号：R651.1密级：公开单位代码：10760学号：107601130698新疆医科大学XinJiangMedicalUniversity博士学位论文THESISOFDOCTORDEGREE临床医学专业学位(学位教育)论文题目：上调miR-130b通过灭活Hippo信号通路来增强胶质瘤干细胞的表型研究生朱国华指导教师更·党木仁加甫专业学位领域外科学研究方向颅内恶性肿瘤研究起止时间2013.9-2016.9所在学院新疆医科大学第一附属医院2015年9月上调miR-130b通过灭活Hippo信号通路来增强胶质瘤干细胞的表型研究生朱国华指导教师更·党木仁加甫专业学位领域外科学研究方向颅内恶性肿瘤2015年9月UpregulationofmiR-130benhancesstemcell-likephenotypeinglioblastomabyinactivatingtheHipposignalingpathwayＡDissertationSubmittedtoXinjiangMedicalUniversityInPartialFullfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofDoctorofMedicineByZhuGuohuaSurgeryDissertationSupervisor：GENG·Dang-murenjiafuProfessorSeptember,2015论文独创性说明本人申明所呈交的学位论文是在我个人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：签字日期：导师签名：签字日期：关于论文使用授权的说明本人完全了解学校关于保留、使用学位论文的各项规定，（选择“同意/不同意”）以下事项：1.学校有权保留本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文；2.学校有权将本人的学位论文提交至清华大学“中国学术期刊(光盘版)电子杂志社”用于出版和编入CNKI《中国知识资源总库》或其他同类数据库，传播本学位论文的全部或部分内容。学位论文作者签名：签字日期：导师签名：签字日期：中英文缩略词对照表英文缩写英文全称中文名称FBSfatalbovineserun胎牛血清EGFepidermalgrowthfactor上皮生长因子FGFfibroblastgrowthfactor成纤维细胞生长因子GFPGreenfluorescentprotein绿荧光蛋白DMEMDulbeccomodifiedeaglemedium改良的基础培养基DMSODimethylSulfoxide二甲基亚讽TUNELTdT-mediateddUTPnickend凋亡实验mRNAmailRNA信使RNARISCRNAinducedsilencingcomplex沉默多蛋白复合物PEIpolyethylenimine聚乙烯酰胺miRNAMicroRNA微小RNAPCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应PBSphosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液TrisTrihydroxymethylaminomethaneN－三羟甲基氨基甲烷TEMEDTetramethylethylenediamine四甲基乙二胺TBStrisbufferedsaline三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水SPFSpecified-pathogensfreeSDSsodiumdodecylsulphate无特定病原体Rpmrevolutionsperminute十二烷基硫酸钠MHCmajorhistocompabilitycomplex每分钟转速GBMglioblastomamultiforme主要组织相容性抗原复合物胶质瘤细胞目录摘要………………………………………………………………………………1Abstract………………………………………………………………………………8前言………………………………………………………………………………15第一部分miR-130b在胶质瘤组织及细胞中表达特性鉴定………………201．资料与方法…………………………………………………………………………202．结果…………………………………………………………………………243．讨论…………………………………………………………………………284.小结……………………………………………………………………30第二部分miR-130b对胶瘤增殖及胶质瘤干细胞成球作用……………………………………………321．资料与方法…………………………………………………………………322．结果…………………………………………………………………………473．讨论…………………………………………………………………………544.小结……………………………………………………………………55第三部分miR-130b对HIPPO信号通路中基因表达的影响……………………………571．资料与方法…………………………………………………………………………572．结果…………………………………………………………………………743．讨论…………………………………………………………………………804.小结……………………………………………………………………81第四部分检测miR-130b与MST1/SAV1的调控关系………………………………………………………………831.资料与方法………………………………………………………………………832.结果………………………………………………………………………1053.讨论………………………………………………………………………1074.小结………………………………………………………………………108结论…………………………………………………………………………………110致谢…………………………………………………………………………………119参考文献………………………………………………………………………………120个人简历………………………………………………………………………………136导师评阅表………………………………………………………………………………137综述………………………………………………………………………………124攻读博士学位期间发表的学术论文………………………………………………………135中文摘要1上调miR-130b通过灭活Hippo信号通路来增强胶质瘤干细胞的表型博士研究生：朱国华导师：更·党木仁加甫摘要研究背景与目的恶性胶质细胞瘤（GBM，世界卫生组织IV级神经胶质瘤）在成年人中它是最常见的恶性的原发性脑肿瘤，它是人类最致命的肿瘤之一。尽管在过去几十年的治疗中不断取得进展，但本病的治疗及愈后仍然很差，在美国和欧洲地区5年生存率平均小于3％。最近的研究已经表明，在胶质瘤细胞中，存在着胶质瘤干细胞（CSCs），胶质瘤干细胞能自我分化并不断的更新增殖成胶质瘤细胞，并导致肿瘤不断增殖生长。本研究目的就是鉴于此理论基础，从恶性胶质细胞瘤中分离表达CD133的细胞，通过一系列实验证实其是高度致瘤性，并且有很强的侵袭性和耐化疗性。然而，对于维持胶质瘤干细胞的分子机制在很大程度上仍然未知。然而，有实验报道，在维持肿瘤干细胞的干性上，人们发现miRNA起到一定的作用，miRNA是一类长度为19～25个核苷酸的非编码单链小RNA分子,参与基因转录后的调节，一般通过靶基因的3’端非翻译区部分互补配对的结合方法来调节调控基因。在生物的生命进程中，广泛参与细胞增殖，生长发育，细胞分化及器官形成等。在生物体生长发育中发挥重要的调控作用。特别是在干细胞的多向分化的调控作用上，有着非常明显的变化，并且越来越受到关注。miRNA是由Lee等在1993年研究线虫的发育过程当中首先发现的，它们是一类非编码的小分子RNA，它们广泛存在于植物和动物体内，长度为19～25个核苷酸。这些长为20nt左右的RNA是被最终剪接而成的成熟体。起初它们在细胞核中转录成初级产物，这些产物被一种叫作RNaseшDrosha的酶切割成前体，它们的前体是由大约90nt的小分子RNA组成的一个发夹结构，并且在exPortin-5蛋白的作用下，被从细胞核转运到细胞质里面来，最后被RNaseшDicer进一步切割，然后变成成熟体，成熟体与其它的蛋白结合，形成RISC复合体，然后一起作用于目的基因的3’端，互补结合，起到抑制目的基因表达的作用，但最新的研究也发现，有些新疆医科大学博士学位论文2miRNA还可以与目的基因的启动区结合，起到促进目的基因表达的作用，但目前所发现的一千多个miRNA来说，绝大多数是在目的基因3’端结合，起到调控目的基因表达的。到目前为止，对miRNA的研究取得很大的进步，发现的miRNA不仅仅数量越来越多，而且现在已知很多miRNA的功能已得到详细的阐述，有研究表明，miRNA对HIPPO信号通路起到重要的调节作用。Hippo信号通路起着限制器官大小和抑制肿瘤发生了至关重要的作用。生物学上表明，Hippo信号通路在很大程度上限制了它的两个下游效应因子，YAP和TAZ。而基因MST1-SAV1的活性直接影响到YAP/TAZ的表达水平，MST1-SAV1直接抑制YAP/TAZ的表达。然而，基因MST1-SAV1复合体是如何抑制YAP/TAZ基因的活性而激活癌症仍不清楚。在此，我们报道了miR-130b的直接抑制MST1和SAV1在人脑胶质瘤细胞中的表达。过表达的miR-130b能够诱导YAP/TAZ的过度活化，增强了Hippo信号通路中的表达下游信号CTGF基因和相关的多能性标志物，包括CD133、SOX2、Nanog、MYC和BMI1表达水平，导致促进胶质细胞瘤干细胞表型的表达增强。相反地，抑制miR-130b能够减弱胶质瘤干细胞的这些特性。这些研究结果为Hippo信号通路抑制癌症的发生和发展的作用，不仅表明miR-130b在胶质细胞瘤的发展中有潜在关键作用提供了一种新的机制，而且为胶质瘤的靶向治疗也提供了一种很好的思路。研究内容与方法1、miR-130b在胶质瘤组织及细胞中表达特性鉴定1.1组织标本和细胞株收集胶质瘤组织标本，胶质瘤组织标本8例，正常组织3例。正常细胞NHA以及胶质瘤细胞SNB19、U87MG、LN444、LN18、U251MG。以上组织及细胞均由本实验室正常保存。1.2miR-130b检测试剂盒为了检测的方便，我们购卖了BioTNT生物公司合成好的套装试剂盒直接用于检测miR-130b的表达水平。该产品货号：CL-has-miR-130b。克隆号：MIMAT0000691，本试剂盒提供了完整的成分，采用茎环逆转录引物，利用QPCR方法，对microRNA进行相对定量检测。其成熟体序列为：CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU1.3组织和细胞总RNA的提取并进行QPCR反应细胞及组织总RNA的抽提按照TRIzol试剂说明书进行。正常细胞NHA以及胶质瘤细胞SNB19、U87MG、LN444、LN18、U251MG生长状态良好时，弃培养基，PBS洗2次，加入1mlTRIzol，组织要用液氮保护研磨，将提取的RNA经分光光度计测浓度和纯度放于EP管中，RNA检新疆医科大学博士学位论文3测完好后用于逆转录反应，然后进行PCR反应，每个样品设置三个复孔，读出样品的CT值，以U6为内参，最终算出样品对于内参的相对浓度。2、miR-130b对胶质瘤增殖及胶质瘤干细胞成球的作用2.1细胞培养NHA（Sciencell）是条件如制造指示下进行培养。胶质母细胞瘤的细胞系SNB19，U87MG，LN444，LN18和U251MG进行常规维持在DMEM培养基（Invitrogen），补充有10％胎牛血清（HyClone公司）。2.