海洋微生物产抗癌活性多羟基甾醇的优化及半合成研究

18海洋微生物产抗癌活性多羟基甾醇的优化及半合成研究陈意光李厚金*林永成*(中山大学化学与化学工程学院，广东广州510275)摘要：以麦角甾醇为原料，KMnO4为氧化剂，一步法氧化反应得到活性四羟基麦角甾醇ergosta-8(9),22-diene-3,5,6,7-tetrol(3β,5α,6α,7α,22E)和ergosta-8(14),22-diene-3,5,6,7-tetrol(3β,5α,6α,7α,22E)，该反应操作和分离纯化工艺简单，产率高，具有进一步的研究与应用前景。研究产活性四羟基甾醇海洋真菌＃2059在特定培养基条件的生长状况及其代谢产物种类和产率的变化。关键词：多羟基甾醇，ergosta-8(9),22-diene-3,5,6,7-tetrol(3β,5α,6α,7α,22E)，ergosta-8(14),22-diene-3,5,6,7-tetrol(3β,5α,6α,7α,22E)，合成，生理活性红树林内生真菌№2059，由国际著名真菌学家EBGJones教授和香港城市大学关利平教授提供，该菌已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉大学校内)，保藏号为CCTCC№：M202030，保藏日为2002年8月3日，我们从该菌的菌体中分离到一个新的四羟基甾醇：ergosta-8(9),22-diene-3,5,6,7-tetraol(3β,5α,6β,7α,22E)。该化合物具有较强的抗癌活性，对正常人肝细胞株L-02，人肝癌细胞株Bel-7402和人大细胞肺癌细胞株NCI-4460的IC50分别为13.621，8.445g/ml和5.03g/ml，对人体正常细胞的毒性小于癌细胞的毒性，其细胞毒具有一定的选择性，该化合物具有明显的制备抗肿瘤药物的研究前景，该研究成果已申请专利（申请号：02134711.5）[17~18]。在真菌№2059的菌体中还分离出其它的甾醇，如：麦角甾醇，3β,5α,6β-三羟基麦角甾醇，5α，8α-过氧化麦角甾醇等。有关四羟基甾醇的文献报道，目前还非常少。据有限的文献报道，四羟基甾醇基本上都具有细胞毒活性，但三羟基甾醇很多并不具有细胞毒，四羟基甾醇中羟基的存在和细胞毒性之间的关系以及其作用机理等现在都还不清楚，这些都值得进一步的研究。进一步的研究工作将对内生真菌№2059及其代谢物在制备抗肿瘤药物方面的进一步研究开发打下基础。本项目将在海洋真菌的菌体中几乎都存在的麦角甾醇用化学半合成方法进行改造，制备得到新的抗癌活性多羟基甾醇，优化反应和分离纯化方法，研究所制备的多羟基甾醇的抗癌和抗菌活性，初步探讨甾体化合物结构与药效之间的关系。本项目还将运用HPLC、LC-MS、UV等现代分离、检测仪器，研究培养基的组成（碳源、氮源、无机盐、生长素和其它金属离子等）、温度、pH值、培养时间等对活性代谢产物产量的影响，确定最佳的培养条件；确定从菌体中分离，纯化该活性代谢物的最佳途径。*基金项目中山大学化学与化工学院第四届创新化学实验基金项目（批准号：03004）资助第一作者陈意光（1981年出生），男，中山大学化学与化工学院应用化学专业00级指导教师李厚金Email：[e-mail],林永成.19HOOHOHOHHOH图1麦角甾醇结构式图2在＃2059中发现的四羟甾醇结构式实验部分1.1麦角甾醇的氧化：1.1.1实验仪器及数据继电器，磁力搅拌反应器，NMR（500MHz），HPLC叔丁醇上海凌峰化学试剂有限公司永华特种化学试剂厂，化学纯;麦角甾醇购于Sigma公司;高锰酸钾广州化学试剂厂，分析纯.1.1.2．反应方程式1.1.3．实验操作(1)将40mg（0.1mmol）麦角甾醇溶于40mL叔丁醇中，外温控制100ºC，加热至回流，然后将事先加热至近沸的，pH用NaOH调为11的，含60mg(0.5mmol)KMnO4100mL加入其中；（2）保持温度，加热回流两个小时；（3）冷却后用EtOAc每次100mL萃取，共萃取三次，合并萃取液，蒸干，得固体42mg；（4）用30mL硅胶拌样。PE：EtOAc＝3：1为溶剂，定极性，硅胶柱层析分离，以试管每份10mL接收，根据薄层层析检测状况进行合并，再用PE:EtOAc=5:1重结晶。（5）将最终分离得到纯品:原料2.1mg,3β,5α,6α-三羟基麦角甾醇6.3mg,ergosta-8(9),22-diene-3,5,6,7-tetraol(3β,5α,6α,7α,22E)，ergosta-8(14),22-diene-3,5,6,7-tetraol(3β,5α,6α,7α,22E)混合物共29.3mg。HOKMnO4/H2OHOOHOHHOOHOHOHHOOHOHOH201.1.4.实验结果化合物的波谱数据3β,5α,6α-trihydroxyergosta-7,22-diene：针状固体，FAB-MSm/z：413[M+1-H2O]+，395，377，341，269，251，227，183，69。IR/cm－1（KBr）：3610，3442，2956，2870，1657，1457，1381，1310，1256，1163，1107，1030，969，938，867。13CNMR（DMSO-d6,TMS,ppm）：139.5（C），135.2（CH），131.3（CH），119.3（CH），74.4（C），72.0（CH），65.9（CH），55.3（CH），54.1（CH），42.9（C），42.2（CH），41.9（CH），40.1（CH2），39.8（CH），38.9（CH2），36.6（C），32.4（CH），32.4（CH2），31.1（CH2），27.5（CH2），22.5（CH2），21.2（CH2），20.8（CH3），19.6（CH3），19.3（CH3），17.5（CH3），17.2（CH3），11.9（CH3）。1HNMR（DMSO-d6,TMS,ppm）5.25（1H），5.19（1H），5.10（1H），3.78（m,1H），3.37（1H），1.84～2.01（m），1.60（2H），1.45～1.50（m），1.24～1.28（m），1.1（d,6.5,3H），0.9（s,3H），0.89（d,6.5,3H），0.82（d,6.5,3H），0.80（d,6.5,3H），0.55（s,3H）。Ergosta-8(9),22-diene-3,5,6,7-tetrol(3β,5α,6α,7α,22E)和ergosta-8(14),22-diene-3,5,6,7-tetrol(3β,5α,6α,7α,22E)：薄片状白色固体。IR(KBr)cm-1:3423,2959,2872,1668,1634,1461,1378,1276,1158,1067,969,915,878,805,733。APCI-MS:m/z429[M-H2O+H]+,411[M-2H2O+H]+,393[M-3H2O+H],375[M-4H2O+H],267,251,187,171,131,105。13CNMR（Acetone-d6,TMS,ppm）：149.8（C），138.8（C），136.8（CH），136.5（CH），133.1（CH），132.9（CH），130.6（C），128.7（C），79.7（C），78.7（C），72.2（CH），71.1（CH），69.9（CH），69.3（CH），66.8（CH），66.7（CH），57.6（CH），55.6（CH），50.9（CH），43.9（CH），41.4（CH），39.9（CH），39.6（CH2），38.0（CH2），37.9（CH2），37.5（CH），37.3（CH2），33.9（CH），32.2（CH2），32.0（CH2），31.7（CH2），30.8（CH2），29.7（CH2），28.2（CH2），25.6（CH2），24.3（CH2），24.0（CH），23.7（CH2），21.8（CH3），21.5（CH3），20.4（CH3），20.3（CH3），20.0（CH3），18.6（CH3），18.1（CH3），17.4（CH3），17.4（CH3），11.9（CH3）。1HNMR（Acetone-d6,TMS,ppm）：5.30（dd,15.0,6.0Hzm），5.26（dd,15.0,6.0Hz），4.48（brs），4.30（brs），4.19（brs），4.01（brs），3.92（m），3.70（dd），3.66（d），3.37（d），3.31，3.18，3.14，3.08，2.62～2.33（m），2.30～2.27（m），2.21～2.11（m），2.04～1.96（m），1.93～1.74（m），1.53～1.22（m），1.17（s,CH3），1.08（d,6.5Hz,CH3），0.95（d,6.5Hz,CH3），0.87（d,8.0Hz,CH3），0.84（d,6.5Hz,CH3），0.70（s,CH3）。抗微生物活性试验在初步的抗微生物活性实验中，反应的乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌有较强的抑制活性，对枯草芽孢杆菌有中等强度的抑制活性，对绿脓杆菌和铜绿假单孢菌有较弱的抑制活性。1.1.5．实验讨论（1）参考文献中以甲基环己烷为溶剂，我们通过实验，薄层层析检测发现产物很多而无主要产物，后来分别试过以吡啶，丙酮，水为溶剂，发现反应转化率极低，效果不好。我们最后以叔丁醇为溶剂，结果非常让人满意，反应物转化率极高，主要产物也超过了百分之五十（2）麦角甾醇在海洋真菌的菌体中广泛存在，反应原料来源丰富。用KMnO4来实现氧化转化，由于只有一种有机原料，其余基本上都是氧化产物。麦角甾醇中含有三个双键，在支链上的双键氢处于反式位置，三个双键的氧化反应活性顺序为：Δ5Δ7Δ22。在该反应条件下，甾醇支链不发生氧化。在产物的分离纯化方面，由于原料和产物之间的羟基数目不同，极性差别比较大，因此，用常规的柱层析就能得到较好的分离。（3）该反应操作和分离纯化工艺简单，产率高，具有很好的应用前景。211.2海洋真菌#2059的培养条件优化培养1.2.1．实验仪器及溶剂无菌操作台，灭菌锅，摇床，HPLC，NMR（500MHz）硅胶，溶剂，生化试剂，1.2.2．两次培养基比较第一次：20g/L的NaCl＋蒸馏水，葡萄糖10g/l,蛋白胨4g/l,酵母膏2g/l.PH7.6第二次：％20人工海水，葡萄糖10g/l,蛋白胨4g/l,酵母膏2g/l.PH7.61.2.3．实验操作：（1）培养基配制及灭菌：培养基共160L以500mL锥形瓶分装，共数百瓶，分批以1.21MPa高温水蒸气灭菌；（2）用处于指数期的＃2059种子接种；（3）在25℃条件下静致无通氧发酵繁殖四个星期；（4）将培养液和菌体分离，培养液在60℃蒸至10L，用等量的乙酸乙脂萃取五次，合并提取液，蒸干。菌体风干后用5L的甲醇浸泡数天，共浸泡五次，合并提取液，蒸干。（5）将菌体和培养液的提取物分别溶解拌样反复过硅胶柱，结合重结晶，HPLC进行分离，将得到的纯品称重，通过有机波谱确定结构，与先前得到的实验结果相比较。本实验现做到提取阶段。致谢非常感谢林永成老师的关心提点和李厚金老师的悉心指导，感谢天然室所以老师学长的帮助。同样感谢有机所和综合实验室老师的支持参考文献[1]HouJinLI,YongChengLIN,L.L.P.VRIJMOED,E.B.G.JONES.AnewcytotoxicsterolproducedbyanendophyticfungusfromCastaniopsisfissaattheSouthChinaSeacoast[J].ChineseChemicalLetters,2004,15(4),419-422.[2]李厚金，林永成，王立，周世宁，L.L.P.Vrijmoed，E.B.G.Jones。南海海洋真菌Hypoxylonoceanicum（3