文库Q-PCR定量标准操作规程

文库Q-PCR定量（Taqman探针定量）标准操作规程1.目的明确文库定量的工作职责，规范文库定量的操作流程。2.应用范围基于AmpliSeq法的Life平台文库测定。3.职责实验人员对执行本规程负责，主管监督检查，质量部人员抽查执行情况。4.试剂、耗材和仪器4.1试剂和耗材试剂名称货号厂家IonLibraryQuantitationKit（250reactions）4468802Life10ul带滤芯低吸附盒装枪头TF-10-L-R-SAxyGen100ul带滤芯低吸附盒装枪头TF-100-L-R-SAxyGen200ul带滤芯低吸附盒装枪头TF-200-L-R-SAxyGen1000ul带滤芯低吸附盒装枪头TF-1000-L-R-SAxyGen上机八连排管B77001BIOplasics上机八连排管盖B57801BIOplasics低吸附1.5ml离心管MCT-150-L-CAxyGen0.2mlPCR管PCR-02-CAxyGen4.2仪器设备型号厂家Real-timePCR仪7500AppliedBiosystemsMINI离心机EP管、8联排昊诺斯单道移液器0.1-2.5μL;Eppendorf单道移液器0.5-10μL;Eppendorf单道移液器10-100μL;Eppendorf单道移液器100-1000μL;Eppendorf单道移液器20-200μL;Eppendorf5.建库流程：6.操作流程6.1E.coliDH10B文库标准品的梯度稀释6.1.1将E.coliDH10B文库标准品置于冰上彻底融化，充分振荡混匀，简短离心后置于冰上备用；6.1.2用Nuclease-freeWater将E.coliDH10B文库标准品（68pM）按下表进行10倍梯度稀释，用移液器将稀释的标准品上下吹打至少10次（不要vortex），混匀后简短离心，置于冰上备用，；名称标准品Nuclease-freeWater终浓度STD15μL（文库标准品）45μL6.8pMSTD25μLSTD145μL0.68pMSTD3STD45μLSTD25μLSTD345μL45ul0.068pM0.0068pM6.2AmpliSeq文库的梯度稀释先将文库按1:20进行稀释，再按1:50进行稀释，建议冰上操作：名称文库Nuclease-freeWater总稀释倍数Sample1-12μL文库38μL1:20Sample1-22μLSample1-198μL1:10006.3PCR反应体系的制备6.3.1试剂准备将2XTaqMan®MasterMix和20XIonTaqMan®Assay置于冰上融化，将20XIonTaqMan®Assay涡旋振荡混匀后离心备用，2XTaqMan®MasterMix轻柔颠倒混匀离心备用（MasterMix不能vortex）；6.3.2反应体系配制：ABI7500PCR仪反应体系：1)20μL反应体系配置：每个样品做2个平行实验，每个实验的反应体系20μL，根据反应总数配制MasterMix和Assay混合的总体系（每10个反应多配1个反应体系）：试剂单个反应加入体积2XTaqMan®MasterMix10μL20XIonTaqMan®Assay1μLH2O4μL2)将配制好的Mix轻柔颠倒混匀后，取15μL分配至八连排荧光定量PCR管；取5μL的稀释的标准品或样品加入至相应的定量PCR管，盖紧PCR管盖，涡旋振荡混匀后离心，冰上放置备用。注：如果使用八连管尽量往中间排版，避免使用第1、2、11、12列。6.4Real-timePCR仪的设置6.4.1依次设置标准品的浓度；6.4.2设置ROX作为参考染料；6.4.3反应体系10μL/20μL；6.4.4选择FAMTM染料/MGB作为TaqMan探针的报告/淬灭剂；6.4.5选择“Fastmode”作为运行模式（StepOnePlus仪器）；6.4.6反应条件设置：阶段温度时间Hold50°C2minHold95°C20sec40Cycles95°C3sec60°C30sec注意事项：A：标准品要输入浓度，样品要选择Target；B：可以在八连排管的一端做标记，但不要在管盖上做标记；C：请确保PCR程序与仪器中的样品分布位置一致；6.5数据的处理文库初始浓度（pM）=qPCR值×稀释倍数。6.6文库pooling6.6.1打开《life文库polling信息单》，输入每个文库的目标数据量，qPCR值和稀释倍数，得到每个文库的目标pooling量和稀释方案。6.6.2在1.5mLEP管中进行文库稀释，然后各取2μL，混匀后再将一半体积的溶液转移到新的PCR管中，加Nuclease-FreeWater补齐100μL。6.6.3下一步制备上机模板，请参考《Life平台乳液PCR和模板富集流程》。