核酸的制备与鉴定项目报告

核酸的制备与鉴定项目报告项目名称：核酸的制备与鉴定班级：10食品组员：柴鲜鲜，王锦，安艳松，蒋玉丹项目实验时间：2011.09.21核酸的提取一·背景知识1·概念核酸是由核苷酸聚合而成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。最早由米歇尔于1868年在脓细胞中发现和分离出来。广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内。生物体内核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。核酸由碳、氢、氧、氮、磷5种元素组成。基本组成成分是磷酸、戊糖和碱基。2·种类按组成成分戊糖不同分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸(RNA)两大类。DNA是生物体主要的遗传物质，通过复制将遗传信息由亲代传给子代。RNA参与蛋白质的合成，与遗传信息在子代的表达有关。细胞中的RNA有三类：信使RNA(mRNA)，核糖体RNA(rRNA)，转移RNA(tRNA)。3·生物合成遗传信息的传递和表达主要通过复制、转录和翻译进行。复制（replication）是指以原来DNA分子为模板，合成出相同DNA分子的过程；转录（transcription）是以DNA分子为模板合成出与其核苷酸顺序相对应的RNA的过程；翻译（translation）是在由rRNA和蛋白质组成的核糖核蛋白体（简称核糖体）上，以mRNA为模板，根据每3个相邻核苷酸决定一种氨基酸的三联体密码规则，由tRNA运送活化的氨基酸，GTP提供所需能量，合成出具有特定氨基酸顺序的蛋白质肽链的过程。4·应用现已发现近2000种遗传性疾病都和DNA结构有关。如人类镰刀形血红细胞贫血症是由于患者的血红蛋白分子中一个氨基酸的遗传密码发生了改变，白化病患者则是DNA分子上缺乏产生促黑色素生成的酷氨酸酶的基因所致。肿瘤的发生、病毒的感染、射线对机体的作用等都与核酸有关。70年代以来兴起的遗传工程，使人们可用人工方法改组DNA从而有可能创造出新型的生物品种。如应用遗传工程方法已能使大肠杆菌长生胰岛素，干扰素等珍贵的生化药物。二：项目实施1、实验目的（1）熟练掌握核酸的性质及应用。（2）掌握核酸分离提纯以及含量测定的方法。2、核酸的提取方法方法一：稀碱法利用细胞壁在稀碱条件下溶解，使释放出来，这种方法提取时间短，但在稀碱条件下不稳定，容易被碱分解。方法二：浓盐法利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M氯纳提取化钠抽提,得到的DNA粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95％乙醇可将DNA钠盐沉淀出来.也可用0.15MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNA,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.方法三：阴离子去污剂法:用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA.由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA方法四:.苯酚抽提法:苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。方法五：水抽提法:利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95％乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66％;80％和95％乙醇以及丙铜洗涤。3·实验所需器材和试剂移液管0.2mL（×1）,2.0mL（×1）,1mL（×4）;量筒10mL（×1）,50mL（×1）;滴管；水浴锅；离心机。0.04MNaOH溶液；95%乙醇；1.5M硫酸；浓氨水；0.1M硝酸银。酸性乙醇溶液：30mL乙醇加0.3mLHCl。三氯化铁浓盐溶液：将2mL10％三氯化铁（FeCl3·6H2O）溶液加入400mL浓HCl。苔黑酚(3,5-二羟基甲苯)乙醇溶液：称取6g苔黑酚溶于95％乙醇100mL。定磷试剂：17％硫酸：将17mL浓硫酸（比重1084）缓缓倾入83mL水中；2.5％鉬酸铵：2.5g鉬酸铵溶于100mL水中；10％抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于100mL水，棕色并保存溶液；临用时将三种溶液和水按下列比例混合：17％硫酸：2.5％鉬酸铵：10％抗坏血酸：水＝1：1：1：2（V/V）。干酵母粉4·提取RNA具体步骤(1)称5g干酵母粉悬浮于30mL0.04MNaOH溶液中并在研钵中研磨均匀。(2)悬浮液转入三角烧瓶，沸水浴加热30min，冷却，转入离心管。3000转/分。（3）离心15分钟后，将上清慢慢倾入10mL酸性乙醇，边加边搅动。（4）加毕，静置，待RNA沉淀完全后，3000r/min离心3min。弃去上清液。（5）用95％乙醇洗涤沉淀两次。再用乙醚洗涤沉淀一次后，用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗抽滤，沉淀在空气中干燥。（6）称量所得RNA粗品的重量。5·RNA组份鉴定取2g提取的核酸，加入1.5M硫酸10mL，沸水浴加热10分钟制成水解液，然后进行组份鉴定。1·嘌呤碱：取水解液10mL加入过量浓氨水。然后加入1mL0.1M硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱化合物沉淀。2·核糖：取水解液1mL，三氯化铁浓盐溶液2mL和苔黑粉乙醇溶液一滴。放沸水浴中加热10min.观察核糖是否变成绿色。3·磷酸：取水解液1mL，加定磷试剂1mL。在水浴中加热观察溶液是否变成蓝色。三·项目实施报告1·实验结果（1）有嘌呤碱银化合物沉淀（2）加热后，溶液变成绿色（3）加热溶液变蓝色，但颜色很淡，并有絮状物。根据上述结论得出：提取出的物品是RNA，但不是很纯，里面有杂质存在。2·实验数据记录编号样品(g)加热时间(min)提取的重量(g)110300.3253·实验问题（1）为什么用乙醇洗涤RNA？（2）为什么在鉴定磷酸时有蓝色絮状物出现，且溶液的颜色很淡？（3）为什么RNA提取的数量这么少？四·RNA的含量测定1·方法：紫外分光吸收法、地衣酚显色法名称优点缺点紫外分光吸收法简单、快速、灵敏度高受蛋白质等的干扰影响地衣酚显色法比较灵敏反应的特异性较差2·所用的器材与试剂紫外分光光度计、烧杯、氢氧化钠3·具体步骤（1）取粗品RNA0.2g，加入2mL0.2%氢氧化钠溶液和1mL蒸馏水溶解，调成糊状。（2）再加入40mL蒸馏水溶液稀释，放置待测。4·实验结果由于分光光度计出现事故，此次试验未能做完，没测出结果。5·实验问题(1)为什么要加入氢氧化钠？五·项目实施中应用的理论知识1·核酸由碳、氢、氧、氮、磷5种元素组成。2·由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。核酸广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内、生物体内核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸，简称RNA和脱氧核糖核酸，简称DNA。DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础，RNA在蛋白质合成过程中起着重要作用，其中转移核糖核酸，简称tRNA，起着携带和转移活化氨基酸的作用；信使核糖核酸，简称mRNA，是合成蛋白质的模板；核糖体的核糖核酸，简称rRNA，是细胞合成蛋白质的主要场所。3·单个核苷酸是由含氮碱基、戊糖和磷酸三部分构成的。碱基(base)：构成核苷酸的碱基分为嘌呤（purine)和嘧啶（pyrimi-dine)二类。前者主要指腺嘌呤（adenine，A）和鸟嘌呤（guanine,G），DNA和RNA中均含有这二种碱基。后者主要指胞嘧啶（cytosine,C）胸腺嘧啶（thymine，T）和尿嘧啶（uracil,U），胞嘧啶存在于DNA和RNA中，胸腺嘧啶只存在于DNA中，尿嘧啶则只存在于RNA中。戊糖(五碳糖):RNA中的戊糖是D－核糖(即在2号位上连接的是一个羟基)，DNA中的戊糖是D－2－脱氧核糖(即在2号位上只连一个H)。D－核糖的C－2所连的羟基脱去氧就是D－2脱氧核糖。戊糖C－1所连的羟基是与碱基形成糖苷键的基团，糖苷键的连接都是β－构型。核苷（nucleoside)：由D－核糖或D－2脱氧核糖与嘌呤或嘧啶通过糖苷键连接组成的化合物。核酸中的主要核苷有八种。核苷酸(nucleotide)：核苷酸与磷酸残基构成的化合物，即核苷的磷酸酯。核苷酸是核酸分子的结构单元。核酸分子中的磷酸酯键是在戊糖C-3’和C-5’所连的羟基上形成的，故构成核酸的核苷酸可视为3’－核苷酸或5’－核苷酸。DNA分子中是含有A,G,C,T四种碱基的脱氧核苷酸；RNA分子中则是含A,G,C,U四种碱基的核苷酸。类别DNARNA基本单位脱氧核糖核苷酸核糖核苷酸核苷酸腺嘌呤脱氧核苷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸腺嘌呤核苷酸鸟嘌呤核苷酸胞嘧啶核苷酸尿嘧啶核苷酸胞嘧啶脱氧核苷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸碱基腺嘌呤（A)鸟嘌呤（G)胞嘧啶（C)胸腺嘧啶（T)腺嘌呤（A)鸟嘌呤（G)胞嘧啶（C)尿嘧啶（U）五碳糖脱氧核糖核糖酸磷酸磷酸4·核苷酸的连接方式（1）3’，5’－磷酸二酯键：核酸是由众多核苷酸聚合而成的多聚核苷酸（polynucleotide），相邻二个核苷酸之间的连接键即：3’，5’－磷酸二酯键。这种连接可理解为核苷酸糖基上的3'位羟基与相邻5'核苷酸的磷酸残基之间，以及核苷酸糖基上的5'位羟基与相邻3'核苷酸的磷酸残基之间形成的两个酯键。多个核苷酸残基以这种方式连接而成的链式分子就是核酸。无论是DNA还是RNA，其基本结构都是如此，故又称DNA链或RNA链。（2）．tRNA二级结构：tRNA二级结构为三叶草型（如右图）。配对碱基形成局部双螺旋而构成臂，不配对的单链部分则形成环。三叶草型结构由4臂4环组成。（3）．tRNA的三级结构：5·核酸的性质（1）核酸的一般性质核酸都是白色固体物质。微溶于水，形成有一定粘度的溶液。易溶于碱金属的盐溶液中，不溶于一般的有机溶剂。常用酒精从溶液中沉淀核酸。核酸和核苷酸既有磷酰基，又有碱基，所以都是两性电解质。核酸和蛋白质一样具有等电点，能进行电泳。利用这一性质可将分子量大小不同的核酸分开。核酸可被酸、碱或酶水解成各种组份，其水解程度因水解条件而异。RNA在室温条件下被稀碱水解成核苷酸，而DNA对碱较稳定，常利用此性质测定RNA的碱基组成或除去溶液中的RNA杂质。RNA与浓盐酸和甲基间苯二酚一起加热，既生成绿色化合物；DNA与二苯胺在酸性条件下加热，产生蓝色化合物。可利用这两种特殊颜色反应区别DNA和RNA或作为两者定量测定的基础。（2）核酸的紫外吸收性质核酸中的嘌呤和嘧啶碱具有共轭双键，能强烈吸收紫外光，因此核酸具有紫外吸收性质。其最大的吸收峰在260nm处。（3）核酸的变形与复性在一定理化因素作用下，核酸双螺旋等空间结构中碱基之间的氢键断裂，变成单链的现象称为变性（denaturation）。引起核酸变性的常见理化因素有加热、酸、碱、尿素和甲酰胺等。在变性过程中，核酸的空间构象被破坏，理化性质发生改变。由于双螺旋分子内部的碱基暴露，其A260值会大大增加。A260值的增加与解链程度有一定比例关系，这种关系称为增色效应（hyperchromiceffect）通常把加热变性时DNA溶液A260升高达到最大值一半时的温度称为该DNA的熔解温度（meltingtemperatureTm），Tm是研究核酸变性很有用的参数。Tm一般在85～95℃之间，Tm值与DNA分子中GC含量成正比。变性DNA在适当条件下，可使两条分开的单链重新形成双螺旋DNA的过程称为复性（renaturation）。当热变性的DNA经缓慢冷却后复性称为退火（annealing）。DNA复性是非常复杂的过程，影响DNA复性速度的因素很多：DNA浓度高，复性快；DNA分子大复性慢；高温会使DNA变性，而温度过低可使误配对不能分离等