桂皮酸透皮吸收影响因素的研究

桂皮酸透皮吸收影响因素的研究王海艳*，季宇彬，李文兰，扈正婷，于莹莹(1.哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心哈尔滨150076，2.国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心哈尔滨150076)摘要目的：通过对桂皮酸在不同药物浓度、接收液、pH值、温度、转速和促渗剂时透皮吸收效果的考察，筛选出桂皮酸透皮吸收效果最佳的条件。方法：采用改良的Franz扩散池，以离体大鼠皮肤为透皮屏障，用高效液相色谱法测定各透皮吸收影响因素对桂皮酸的累积渗透量、透皮吸收速率、透皮时滞等体外透皮吸收动力学参数的影响。对氮酮(Azone)、丙二醇(PG)、油酸(OA)、月桂酸甘油酯(GL)、乙醇(Ethanol)5种透皮吸收促进剂单独应用和合用的促渗效果进行考察。结果：在接收液为10%乙醇-生理盐水，药物浓度为200µg/mL，37℃水浴恒温，pH=7，转速为300r/min时桂皮酸的透皮吸收效果最佳，以1%Azone+0.5%OA+10%GL+10%PG、0.5%OA+10%GL+10%PG、10%GL+10%PG为复合促进剂时吸收速率显著提高，其中以1%Azone+0.5%OA+10%GL+10%PG促渗作用最强。结论：通过考察各影响因素对桂皮酸透皮吸收的影响，为研究其透皮给药提供了参考依据。关键词：桂皮酸；透皮吸收；促渗剂；HPLCStudyoninfluencingfactorsofpercutaneousabsorptionofcinnamicacidWANGHai-yanJIYu-binLIWen-lanHUZheng-tingYUYing-Ying(CenterofResearchonLifeSciencesandEnvironmentalSciences,HarbinUniversityofCommerce,HarbinChina150076,；Engineeringresearchcenterofnaturalanticancerdrugs,ministryofeducatuion,HarbinChina150076)AbstractObjective:Studiedthepercutaneousabsorptioneffectsofcinnamicacidatdifferentconcentration,receivingsolution,pHvalue,temperature,rotationalspeed,andpenetrationenhancer.Screenedtheoptimumconditionofpercutaneousabsorption.Methods:ImprovedFranzdiffusioncellwasadoptedastheapparatusforinvitrorats’skinpermeation.Kineticparametersofpercutaneousabsorption,suchaspermeabilityamount,penetrationrateandpercutaneoustime-delay,weredeterminatedbyHPLC.Futhermore,azone,propyleneglycol,oleicacid,glycerylmonolaurateandethanolwereinvestigatedinpercutaneousabsorptioneffectsforsingleorcombineduse.Results:Theoptimumconditionis10%基金项目：黑龙江省科技厅攻关项目(GC05C31601)；黑龙江省教育厅振兴老工业基地项目（1151gzd25）；黑龙江教育厅科学技术研究项目（10551089）作者简介：王海艳(1981年-)，女，黑龙江省肇州县，研究生，研究方向为中药学，Tel:[phone],E-mail:[e-mail]ivingsolution,administrationconcentrationis200µg/mL,37℃,pHvalueis7,rotationalspeedis300r/min.When(1%Azone,0.5%OA,10%GLand10%PG),(0.5%OA,10%GLand10%PG)and(10%GLand10%PG)arechosedascompoundpenetrationenhancer,penetrationratewereincreasedsignificantly,and,thefirstonehadthebesteffect.Conclusion:Theresearchwillprovideexperimentaldataforskinadministrationofcinnamicacidthroughinvestigatedtheseinfluencingfactors.Keywords:cinnamicacid;percutaneousabsorption;penetrationenhancer;HPLC透皮给药(TTS)又称经皮给药(TDS)，是指药物以一定的速率通过皮肤，经毛细血管吸收进入循环而产生药效的一类给药方式。具有其它给药方式所不具备的优点：它可避免肝脏首过效应，免去人体胃酸和酶对药物的破坏和降解；毒副反应小，出现不良反应时可随时中断治疗；接近于靶器官，药物以恒定的速率进入体内，病人易于接受[1]。正因为这些优点，透皮给药是目前药物研究的热点之一。桂皮酸(cinnamicacid)是中药肉桂的有效成分之一，也可来源于钻山风，枸杞根皮，苏合香，茴香叶等中草药，具有抗炎与抗真菌作用，且还具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化、抑制肿瘤细胞侵袭的作用[2-3]。肉桂有补火助阳，引火归源，散寒止痛，活血通经等功效，在《金匮要略》中，以肉桂为主要药物组成的方近三十首，是中药外用治疗关节炎使用频率较高的一味中药。因此，我们对桂皮酸透皮吸收各影响因素进行了实验研究，旨在为所有含桂皮酸的药物经皮给药制剂提供依据。1材料1.1仪器岛津HPLC（LC-10AT泵，SPD-10A检测器，微量进样器，N-2000双通道色谱工作站）；改良的Franz扩散池（上海锴凯科技贸易有限公司提供）；恒温磁力搅拌器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；pH计（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；电子天平（美国奥好斯科技有限公司）。1.2药品桂皮酸：(中国药品生物制品检定所，批号111302-200504，纯度98％)1.3试剂氮酮；油酸；1，2-丙二醇；乙醇；月桂酸甘油酯；双蒸水；甲醇（色谱纯）；冰醋酸（色谱纯）以上化学试剂均为国产。1.4动物Wistar大鼠(225±20)g购自长春国家生物产业基地实验动物中心合格证号SCXK-(吉)2003-0004。2方法与结果2.1离体皮肤样品的制备与保存大鼠断颈处死后用电动剃须刀将其背部毛剃干净，立即剪取背部皮肤，将取下的皮肤平铺于干净的玻璃板上，角质层朝下，仔细剥离皮下脂肪层和结缔组织，用生理盐水反复冲洗干净，置于生理盐水中浸泡，于低温冰箱保存备用，实验前自然解冻，并用生理盐水浸泡0.5h，于1周内进行实验。每次实验前目视检查皮肤的完整性，不能有任何破损。2.2桂皮酸色谱条件的建立色谱柱：岛津C18（150×4.6mm，5μm）；流动相：1％冰醋酸水溶液-甲醇（55:45）；检测波长：285nm；流速：0.8mL/min。2.3标准曲线绘制精密称取桂皮酸标准品4mg，用甲醇定溶于10mL容量瓶中，配制成浓度为0.4mg/mL的桂皮酸标准品溶液。再以适量的甲醇将其分别稀释为80、40、20、10、5、2.5、1.25μg/mL的标准品溶液。过0.45μm微孔滤膜，分别进样16μL，以峰面积对浓度进行线性回归，求出桂皮酸标准曲线方程为：Y=5×106X+11028R=0.9999，（n=3）表明桂皮酸在0.01－1.28μg/mL范围内线性关系良好。2.4方法学考察2.4.1精密度实验精密吸取桂皮酸标准品溶液（0.04mg/mL），连续5次进样16μL，测定峰面积，RSD为0.35%，表明精密度良好。2.4.2回收率实验取已知含量的样品溶液6份，分别加入桂皮酸标准品溶液（0.04mg/mL）0.5，0.5，1.0，1.0，1.5，1.5mL，在上述色谱条件下测定桂皮酸的含量，计算其平均回收率为99.53%，RSD为1.07%（n=6）。2.4.3稳定性实验将桂皮酸标准品配制成浓度为0.04mg/mL的水溶液，置于37℃的水浴中加热，分别于2，4，6，8，10，12，24h取样，测定桂皮酸含量，以峰面积计算RSD为0.83%，结果表明供试品溶液在24h内稳定。2.5桂皮酸透皮吸收实验取出冷藏备用大鼠背部皮肤，自然解冻，将皮肤固定于改良Franz扩散池上(供给室和接收池直径为2cm，面积为3.14cm2)，使角质层面向上，用弹簧夹固定，在供给池中加入2mL渗透促进剂溶液，接收池中加入7mL生理盐水作为接收液，夹层以37℃水浴恒温，磁力搅拌子以100r/min的速度搅拌，分别于2，4，6，8，10，12，24h取出接收室中1mL接收液，立即补加等量的预温37℃的新鲜接收液。取出的接收液过0.45μm微孔滤膜，用高效液相色谱法测定桂皮酸含量。并按下列公式计算累积渗透量（Q）。式中，Cn：第n个取样点测得的药物浓度(μg/mL)；Ci：第i个取样点测得的药物浓度(μg/mL)；A：渗透面积(cm2)；以累积渗透量Q对时间t进行线性回归所得方程即为Higuchi方程，根据直线方程可以求出稳态流量（P）和滞后时间（Tlag），渗透系数（Pm）等于药物的稳态流量除以供药池中药物溶液的浓度；增渗比(EF)的计算以对照组桂皮酸的稳态流量为参比而得。2.5.1接收液对桂皮酸透皮吸收的影响400µg/mL桂皮酸水溶液为供给液，37℃水浴恒温，100r/min的速度搅拌条件下，考察以生理盐水、10%、20%（v/v）乙醇-生理盐水为接收液时桂皮酸透皮吸收情况，讨论接收液对桂皮酸透皮吸收的影响。透皮速率常数和Higuchi方程见表1。表1不同接收液时桂皮酸透皮速率常数和Higuchi方程（x±s，n=5）接收液Higuchi方程RP/[μg/(cm2·h)]Tlag/h生理盐水Q=0.0665t+0.31950.94420.0665±0.01894.80±3.5210%乙醇-生理Q=0.1101t+0.08890.97140.1101±0.01290.81±0.7420%乙醇-生理Q=0.0849t+0.13300.96750.0849±0.01021.57±2.25结果表明：接收液对桂皮酸透皮吸收的影响较大(p0.05)，综合稳态流量P和滞后时间（Tlag）两个参数比较，以10%乙醇-生理盐水为接收液时，桂皮酸透皮吸收效果最佳。2.5.2浓度对桂皮酸透皮吸收的影响10%乙醇-生理盐水为接收液，37℃水浴恒温，100r/min的速度搅拌条件下，考察给药浓度分别为200、300、400µg/mL时桂皮酸透皮吸收情况，讨论给药浓度对桂皮酸透皮吸收的影响。透皮速率常数和Higuchi方程见表2。表2不同药物浓度的桂皮酸透皮速率常数和Higuchi方程（x±s，n=5）桂皮酸浓度(µg/mL)Higuchi方程RP/[μg/(cm2·h)]Tlag/hPm/(cm2·h)200Q=0.0552t+0.03830.96590.0552±0.00120.69±0.302.76×10-4300Q=0.0813t+0.07290.99800.0813±0.00230.90±0.682.71×10-4400Q=0.1101t+0.08890.97140.1101±0.01290.81±0.742.75×10-4结果表明：桂皮酸透皮吸收的稳态流量P随着给药浓度的增加而升高，由于给药浓度不同，我们应该从渗透系数(Pm)和滞后时间