桃红四物汤乙醇提取液体外抗羟自由基作用的研究

桃红四物汤乙醇提取液体外抗羟自由基作用的研究▲摘要目的：研究桃红四物汤的乙醇提取液的抗羟自由基的活性。方法：采用分光光度法,对桃红四物汤醇提液体外抗羟自由基活性进行测定。邻二氮菲与Fe2+反应形成红色配合物,H2O2和Fe2+产生•OH，加入抗羟自由基的物质后，减弱了•OH对Fe2+/邻二氮菲的氧化作用，引起吸光度变化，本实验使用721型分光光度计,在510nm处测定其吸光度值,根据吸光度的变化值间接测定其抗羟自由基能力，并以没食子酸作为阳性对照。结果：桃红四物汤乙醇提取液对羟自由基清除率达到50%时所需药物的终浓度（IC50）为14.9±0.4µg/mL。结论：桃红四物汤醇提液对羟自由基具有清除作用,与对照组比较,作用弱于相同剂量的没食子酸。关键词：桃红四物汤；分光光度法；抗羟自由基桃红四物汤出自《医宗金鉴》，由桃仁、红花、当归、川芎、熟地、白芍组成。桃红四物汤在预防动脉粥样硬化和改善心血管疾病方面具有一定作用[1]，可能与抗氧化作用有关，因此，研究桃红四物汤的抗氧化活性具有一定意义。在众多的自由基中，羟自由基是最活泼的，其反应速度极快，它是对机体危害最大的自由基，超过了其它氧自由基[2]，所以本实验进行桃红四物汤醇提液体外抗羟自由基的实验研究。清除羟基自由基的测定方法很多，目前多采用邻二氮菲-金属铁离子-H2O2体系[3-5]。本文通过检测桃红四物汤醇提液体外抗羟自由基的活性，为桃红四物汤抗氧化产品的开发，研究提供相关依据，对进一步地阐明该方的药效物质基础具有重要意义。材料与方法1仪器和试剂1.1中药材红花、桃仁、当归、川芎、熟地、白芍，购自张垣中药饮片有限公司1.2主要试剂无水乙醇天津市大茂化学试剂厂邻二氮菲批号2002年1月28日天津市远航化学品有限公司经销硫酸亚铁批号2003年3月9日天津市博迪化工有限公司磷酸氢二钠批号200208-3北京市红圣化工厂磷酸二氢钾批号910821天津市化工试剂六厂H2O2天津市东方化工厂没食子酸批号：110831-200302中国药品生物制品鉴定所。1.3主要仪器索氏提取器，电光分析天平TG-328A型（上海天平仪器厂），微量分析天平TG-322A（上海天平仪器厂），电热恒温水槽DK-8B型（上海精宏实验设备有限公司），微电脑智能化控制新型电热恒温鼓风干燥箱DHG-9070AS（宁波江南仪器厂），721型可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）2方法2.1实验原理根据文献[6]，邻二氮菲与Fe2+反应生成红色配合物H2O2+Fe2+→HO·+HO-+Fe3+具有抗羟自由基能力的物质能抑制上述反应的发生，加入抗羟自由基的物质后，减弱了•OH对Fe2+/邻二氮菲的氧化作用，引起吸光度变化，本实验利用分光光度法测定其样品吸光度值的改变值来间接测定桃红四物汤的抗羟自由基能力。2.2桃红四物汤乙醇提取液的制备精密称取桃红四物汤5g，石油醚脱脂后，用75％的乙醇回流提取2h，滤液常压浓缩定容至50.0mL备用。2.3试液的制备2.3.1没食子酸溶液的制备精密称取11.14mg的没食子酸，加水溶解，室温冷却，定容至100mL容量瓶中，得浓度为0.1114mg／mL的储备溶液。使用时将储备液分别稀释20倍、25倍、35倍、50倍、100倍。2.3.2PBS的制备称取14.3g的Na2HPO4·12H2O，加水溶解，室温冷却，定容至200mL容量瓶中，得浓度为0.2mol/L的溶液；称取2.7g的KH2PO4，加水溶解，室温冷却，定容至100mL容量瓶中，得浓度为0.2mol/L的溶液。配制时取81mL的Na2HPO4溶液，19mL的KH2PO4溶液，混合均匀，即得PH7.4的PBS溶液。2.3.3邻二氮菲溶液的制备精密称取0.1489g的邻二氮菲，加水溶解，室温冷却，定容至200mL容量瓶中，得浓度为3.8×10-3mol/L的溶液。2.3.4硫酸亚铁溶液的制备精密称取0.2084g的FeSO4·7H2O，加稀盐酸溶液溶解，室温冷却，加蒸馏水定容至100mL容量瓶中，得浓度为7.5×10-3mol/L的储备液，实验时，将储备液稀释10倍使用。2.3.5H2O2溶液的制备精确量取30%的H2O2溶液0.25mL，室温下定容至25mL的容量瓶中，得0.3%的H2O2储备液，实验时，将储备液稀释为0.1%的溶液使用。2.4羟自由基清除率测定波长的选择根据实验原理，羟自由基清除率的测定实际上就是根据测定邻二氮菲-Fe2+溶液的吸光度值来间接测定样品的抗羟自由基能力。在721型分光光度计上，用0.5cm比色皿以蒸馏水为参比溶液，在480nm-540nm之间，测定邻二氮菲-Fe2+溶液的吸光度值，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制吸收曲线，测得最大吸收波长为510nm，结果见图1。2.5羟自由基清除率的测定参照实验[7]方法，取7支试管,分别加入pH7.4的PBS溶液1.0mL，3.8×10-3mol/L邻二氮菲溶液0.5mL,充分混匀后,加入7.5×10-4mol/LFeSO4溶液0.5mL,每加1管立即混匀。然后向其中5支试管分别加入0.5mL浓度不同的桃红四物汤醇提液,混匀,另两支试管为损伤管和未损伤管,不加醇提液，但加入相同体积的75%的乙醇溶液（目的是扣除桃红四物汤醇提液中乙醇溶剂的影响）。再分别加入0.1%H2O20.5mL,未损伤管不加H2O2,以蒸馏水补充体积。在37℃保温1h,测定A510,重复五次。考察不同浓度的提取液对·OH的清除率，乙醇提取液的终浓度分别为27.78µg/mL、13.89µg/mL、6.944µg/mL、3.472µg/mL、1.736µg/mL。以没食子酸为阳性对照,进行实验。·OH的清除率（E%）=[(A2-A1)/(A0-A1）]×100%其中:A0未损伤管的吸光度值,A1损伤管的吸光度值,A2加样品管的吸光度值。3结果3.1邻二氮菲-Fe2+溶液的吸收曲线在721型分光光度计上，用0.5cm比色皿以蒸馏水为参比溶液，在480nm-540nm之间，测定邻二氮菲-Fe2+溶液的吸光度值，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制吸收曲线，最大吸收波长为510nm，结果见图1。3.2没食子酸对羟自由基的清除作用按实验方法，分别测定各浓度的没食子酸稀释液的吸光度值，以浓度为横坐标，清除率为纵坐标作图。求出回归方程为：y=70.7x+3.52，r=0.9873，IC50值为0.661±0.04µg／mL，结果见表1和图2。3.3桃红四物汤醇提液对羟自由基的清除作用按实验方法，分别测定三份各浓度的桃红四物汤稀释液的吸光度值，计算相应的清除率。以浓度为横坐标，清除率为纵坐标作图，求出回归方程为：y=2.385x+10.683，IC50值为14.9±0.4µg／mL。3.4桃红四物汤乙醇提取液清除羟自由基的IC50值按实验方法，对三份桃红四物汤的乙醇提取液清除羟基自由基的能力进行了研究，结果见表2。3.5精密度实验按照实验方法，对样品管、损伤管、未损伤管分别重复测定5次，并计算各自的RSD值，实验结果见表3，结果表明该实验精密度良好。3.6重复性实验精密称取同一批药材3份，制备乙醇提取液，测定其各自抗羟自由基的能力，并计算IC50和RSD值，RSD值为2.7%，结果表明重复性良好。4讨论4.1羟自由基是目前所知活性氧中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基。它可以通过电子转移、加成以及脱氢等方式与生物体内的多种分子作用,造成糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等物质的氧化性损伤,使细胞坏死或突变；羟自由基还与衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬等有关。故羟自由基的清除,对维持生物机体正常的生理活动和抗衰老具有重要意义，羟自由基消除率是反映抗氧化作用的重要指标[8]。4.2没食子酸抗氧化的能力很强，本文用桃红四物汤乙醇提取液与没食子酸溶液清除羟基自由基的能力进行对比，为进一步研究桃红四物汤的抗氧化活性提供依据。4.3桃红四物汤乙醇提取液的IC50值为14.9±0.4µg／mL（以生药的质量计算），没食子酸的IC50值为0.661±0.04µg／mL，桃红四物汤乙醇提取液的IC50值是没食子酸IC50值的22.5倍，如果进一步提纯分离有望开发为天然抗氧化产品。附表表1没食子酸对羟自由基的清除作用（±S,n=5）Table1Thescavengingeffectofgallicacidonhydroxylradical（±S,n=5）没食子酸浓度（µg／mL）吸光度（A510nm）清除率（E%）0.92830.74270.53040.420±0.0130.409±0.0080.359±0.00366.3±5.961.5±3.739.2±1.30.37130.18570.333±0.0020.310±0.00528.1±7.717.5±2.1表2桃红四物汤醇提液清除羟自由基的IC50值（±S,n=3）Table2IC50ofthehydroxylradicalscavengersofTaohongsiwuethanolextract（±S,n=3）序号123xsxIC50(µg／mL)14.515.614.614.9±0.4表3精密度实验（n=5）Table3Precisionexperiments（n=5）吸光度（A1）吸光度（A2）吸光度（A3）吸光度（A4）吸光度（A5）±SRSD%样品管损伤管未损伤管0.3370.2640.4900.3420.2670.5000.3340.2600.4900.3370.2600.4970.3400.2630.4890.338±0.0030.263±0.0030.493±0.0050.891.11.0表4桃红四物汤乙醇提取液与没食子酸清除羟自由基的IC50值（±S,n=3）Table4IC50ofthehydroxylradicalscavengersofTaohongsiwuethanolextractandgallicacidscavenging（±S,n=3）桃红四物汤醇提液没食子酸IC50（µg／mL）14.9±0.4▲0.661±0.04▲P0.01（与没食子酸相比）附图0.350.370.390.410.430.450.470.490.510.53480500520540A图1邻二氮菲-Fe2+体系的吸收光谱Fig1Absorptionspectraofphenanthroline-Fe2+y=70.7x+3.52r=0.98730102030405060708000.20.40.60.81C（µg/mL）E%图2没食子酸对羟自由基的清除作用Fig2Thescavengingeffectofgallicacidonhydroxylradicaly=2.385x+10.683r=0.98450102030405060708090051015202530C（µg/mL）E%y=2.385x+10.683r=0.98450102030405060708090051015202530C（µg/mL）E%y=2.385x+10.683r=0.98450102030405060708090051015202530C（µg/mL）E%y=2.385x+10.683r=0.98450102030405060708090051015202530C（µg/mL）E%y=2.385x+10.683r=0.98450102030405060708090051015202530C（µg/mL）E%图3桃红四物汤醇提液对羟自由基的清除作用参考文献[1]周小青,罗尧岳,谢小兵,等.五首活血化瘀方对实验性动脉粥样硬化家兔血脂、载脂蛋白变化的影响[J].中国中医药信息杂志,2003,10(4):29-31.[2]王海宽,赵新淮,姜岩.甘草有效成分分离及其对自由基的清除能力[J].食品与机械,2000,(4),23-24.[3]蔡仲军,陈仕江,尹定华,等.不同产地冬虫夏草清除羟自由基作用的研究[J].中草药,2004,35(1):57-59.[4]张静丽,王宏勋,