植物基因组DNA的提取及检测门颖丽

学年论文（本科）学院生命科学专业生物科学年级2009级姓名门颖丽论文题目植物基因组DNA的提取及检测指导教师卢东升职称教授成绩2011年5月19日学号：20095071177目录摘要································1关键词································1Abstract·······························1Keywords·······························10引言································11实验材料与方法····························21.1实验材料····························21.1.1实验材料的选择······················21.1.2实验材料的保存和预处理··················21.2实验方法····························21.2.1CTAB缓冲液法······················21.2.2SDS缓冲液法·······················32结果分析······························32.1琼脂糖凝胶电泳检测结果····················32.2紫外分光光度计检测结果····················42.3实验结果分析·························43实验讨论······························53.1酚类物质···························53.2多糖物质···························5参考文献：······························6植物基因组DNA的提取及检测学生姓名：门颖丽学号：20095071177学院：生命科学学院专业：生物科学指导教师：卢东升职称：教授摘要:基因组是指细胞中的所有DNA，包括所有的基因和基因间区域。植物除了细胞核基因组外，还有细胞质基因组，后者包括线粒体基因组和质体基因组。特定物种的基因组，包含了该物种生长、发育以及繁殖等各项生理活动的几乎全部信息。研究基因组DNA，要求提取的DNA要有较高的纯度和得率，以便用于PCR、RFLP分析、基因文库的构建以及基因探测等后续研究。对近年来关于植物基因组DNA研究中的采样、DNA提取方法以及纯化技术的研究进展进行综合评述，旨在为植物基因组DNA的研究提供理论与技术参考。从琼脂糖凝胶电泳检测和紫外分光光度计检测的结果可以看出，菜花组织中酚类、多糖等化合物直接会影响实验中提取DNA的纯度和质量，因此从中提取DNA的关键是有效地除去这些杂质。关键词：植物基因组DNA；提取；检测Abstract:GenomereferstoalltheDNAcells,includingallofthegeneandgeneroomarea.Plantsinadditiontothenucleus,besidesthegenome,whichincludesthecytoplasmgenomemitochondrialgenomeandplasmidsgenome.Specificgenomes,containsthespeciesgrowth,developmentandreproductionandsooneachphysicalactivityalmostallinformation.ResearchgenomicDNAextractedDNA,demandinghighpurityandyieldforPCR,RFLPanalysis,genelibraryconstructionandgenedetectionetcfollow-upstudy.AboutplantsinrecentyearsinthestudyofgenomicDNAsampling,DNAextractionmethodandpurificationtechnologyresearchprogressonacomprehensivereviewaimedattheplantgenomicDNAresearchprovidestheoryandtechniquereference.Fromagarosegelelectrophoresisanduvspectrophotometertestingresultscanbeseen,cauliflowerorganizationphenols,polysaccharidedirectlyaffectchemicalcompoundssuchasextractingDNAexperiment,sothepurityandqualityisthekeytoextractDNAfromeffectivelyremovetheseimpurities.Keywords:plantgenomicDNA;extracted;detection0引言基因组是指细胞中的所有DNA，包括所有的基因和基因间区域。植物除了细胞核基因组外，还有细胞质基因组，后者包括线粒体基因组和质体基因组。特定物种的基因组，包含了该物种生长、发育以及繁殖等各项生理活动的几乎全部信息。研究基因组DNA，要求提取的DNA要有较高的纯度和得率，以便用于PCR、RFLP分析、基因文库的构建以及基因探测等后续研究。而在DNA的提取过程中,采样时间、提取方法以及纯化技术等因素都对提取DNA的纯度和得率有很大影响,进一步影响对DNA的分析等后续研究。对近年来关于植物基因组DNA研究中的采样、DNA提取方法以及纯化技术的研究进展进行综合评述，旨在为植物基因组DNA的研究提供理论与技术参考。掌握从高等真核生物细胞中制备基因组DNA的基本原理，熟悉从高等植物中提取基因组DNA的技术流程。1实验材料与方法1.1实验材料实验材料的处理包括2个方面：一为实验材料的选择；二为实验材料的保存和预处理。总体上讲，在材料的选取上，应尽量采用植物的幼嫩部位，但仍应根据实验条件如植物的生长周期、实验室离材料生长地的距离、植物本身的生化性质来选用何种部位为材料。一般都取植物的嫩叶进行实验，而一些衰老的叶片则可以先在4℃的黑暗中饥饿1d，以消耗掉淀粉和其它多糖类物质。除叶片外，植物的另外一些部位有时也可以成为较好的试验材料[1]。1.1.1实验材料的选择实验材料以菜花幼嫩叶片为实验材料，采集新鲜叶片数片洗净后再用去离子水清洗2次，晾干，置于4℃冰箱冷藏室内备用。1.1.2实验材料的保存和预处理为了得到高质量的基因组DNA，应采用正确的保存方法使得样品材料尽量不要受到机械损伤和不被氧化褐变，DNA不为内源核酸酶催化降解等。常用的保存方法有低温保存和脱水干燥保存2种[2]。1.2实验方法提取基因组DNA时，细胞裂解是必经的步骤，而能否得到高质量的DNA，这一步非常重要。其中，裂解缓冲液的组成以及温浴的时间和温度都与结果有直接或间接的关系。细胞裂解缓冲液中一般含有表面活性剂，常用的有CTAB和SDS。缓冲液成分一般应根据分离对象、后续实验对DNA产品的质量及数量的要求不同进行选择和调整，缓冲液的pH、保护剂和表面活性剂的种类及含量等都要事先进行优化[3]。1.2.1CTAB缓冲液法取超低温(-86℃)保存的健康无病斑菜花(约1g)，放置在冷冻的研钵中，在研磨时加入适量的抗坏血酸和聚乙烯吡咯烷酮，用冷冻的研杵快速研磨成干粉状，装入1.5mL的Eppendorf中1/3体积，迅速加入680μL、65℃预热的CTAB缓冲液和100μLβ-巯基乙醇，上下颠倒数次，使材料与缓冲液充分混匀，然后置于65℃水浴中水浴1小时后，取出Eppendorf管稍冷却，加氯仿-异戊醇(24∶1)混合液至1.5mL，混合后于8000rpm离心10min，吸取上清，重复此步骤至看不到界面上有白色沉淀环。加入2倍体积的冷乙醇或2/3体积的异丙醇，4℃静置30min,12000rpm离心20s，弃上清液，加入500μLDNA洗涤缓冲液，放置30min，倒去洗液，用70%乙醇洗涤2次，空气中自然干燥或用吹风机(冷风)吹干，溶于80μL0.1×TE中，置于-20℃保存备用[4]。1.2.2SDS缓冲液法实验步骤：取幼嫩无病斑菜花(约1g)置于冰冻的研钵中，加入适量固体抗坏血酸和聚乙烯吡咯啉酮，研成粉末，装入1.5mL的Eppendorf中1/3体积，加入预热至65℃的提取介质680μL和β－巯基乙醇100μL，2%的抗坏血酸50μL和2%的聚乙烯吡咯啉酮50μL，65℃温浴1.5h，用氯仿-异戊醇抽提2—3次至界面上无白色沉淀环为止。取上清液，加入2/3体积的2.5mol/LpH4.8的KAC溶液，2%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液及β－巯基乙醇各10μL0℃放置30min后，低温(4℃10000rpm)离心10min，上清液中加入2倍体积的冷乙醇，4℃静置30min后，4℃12000rpm离心30s收集沉淀。经洗涤缓冲液洗涤数次，再用70%乙醇洗涤2次，自然风干，并溶于40μL0.1×TE溶液中，置于-20℃保存备用[5]。2结果分析2.1琼脂糖凝胶电泳检测结果将所得的DNA样品于0.8﹪琼脂糖凝胶中进行电泳，用凝胶成像系统分析电泳结果，并判断DNA浓度及相对分子质量大小。高盐溶液中除含有CTAB-核酸复合物外，还含有大量的多糖和蛋白。用氯仿先对此高盐溶液进行抽提，大量蛋白和多糖等被从溶液中抽提沉淀出来，而核酸仍留在溶液中；接着可用乙醇或异丙醇将核酸从溶液中沉淀出来，然后用水或TE缓冲液等将核酸溶解。由CTAB法、SDS法分离提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳后，其电泳带可见1条约15kb的DNA主带，点样孔内无亮点，带型清晰无拖尾，说明所提取的DNA保持完好。其中用CTAB法所提取的基因组DNA主带最亮、最清晰，提取的质量最好，DNA的质量浓度最大；而用SDS法所提取的基因组DNA有降解现象[6]。1：CTAB法；2：SDS法；图：改进方法提取基因组DNA的比较2.2紫外分光光度计检测结果将所得的DNA提取液于752型紫外分光光度计上测定波长260,280nm处的吸光度:根据A260/A280的值判断DNA纯度，以A260计算DNA质量浓度并得出DNA得率。我们采用CTAB法、SDS法提取菜花的基因组DNA，在有效除去细胞内杂质，抑制次生代谢物与DNA的结合，所得的DNA溶液呈无色透明状。将这两种方法所得的DNA吸取10uL用去离子水稀释至3mL，在752型分光光度计上测定其A260，A280，判断其纯度得率。用CTAB法、SDS法提取的基因组的A260/A280的值在1.8-2.0之间，纯度较高，符合分子生物学研究。其中CTAB法所提取的DNA纯度最高，质量浓度也最大。表：用不同方法提取的基因组DNA测定结果基因组DNA提取法A260A280A260/A280DNA质量浓度（ug.uL-1）CTAB法0.1930.0981.972.895SDS法0.11310.0701.871.9652.3实验结果分析由琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测结果，我们可以清楚的看到在对菜花的基因组DNA提取的试验中，CTAB缓冲液法的效果明显比SDS缓冲液法好。产生这种结果的主要原因可能是，CTAB缓冲液比较适用于草本植物和不含酚类或含酚类较少的植物DNA提取；SDS缓冲液在植物基因组DNA的提取中应用较少，主要应用于对模板DNA质量要求不太严的RAPD分析。因此在提取菜花这种属于十字花科的植物来说，CTAB缓冲液对于提取其的DNA更加适合[7]。3实验讨论从琼脂糖凝胶电泳检测和紫外分光光度计检测的结果可以看出,菜花组织中酚类、多糖等化合物直接会影响实验中提取DNA的纯度和质量,因此从中提取DNA的关键是有效地除去这些杂质。3