植物组织培养的培养基

★植物组织培养培养基的主要成分1.无机营养物：无机营养物主要由大量元素和微量元素两部分组成，大量元素主要包括氮、磷、钾、钙、镁和硫六种，氮源通常有硝态氮或铵态氮，但在培养基中用硝态氮的较多，也有将硝态氮和铵态氮混合使用的。磷和硫则常用磷酸盐和硫酸盐来提供。钾是培养基中主要的阳离子，在近代的培养基中，其数量有逐渐提高的趋势。而钙、钠、镁的需要则较少。培养基所需的钠和氯化物，由钙盐、磷酸盐或微量营养物提供。微量元素包括碘、锰、锌、钼、铜、钴和铁,这些元素有的对生命活动的某个过程十分有用，有的对蛋白质或酶的生物活性十分重要，有的是参与某些生物过程的调节。培养基中的铁离子，大多以螯合铁的形式存在，即FeSO4与Na2—EDTA（螯合剂）的混合。2.碳源：培养的植物组织或细胞，它们的光合作用较弱。因此，需要在培养基中附加一些碳水化合物以供需要。培养基中的碳水化合物通常是蔗糖或D-葡萄糖，用量通常为2%-4%，高者可达5%，亦可用市售的白糖所代替，但一般应增加用量，而且最好用比较固定的厂家生产的产品，以保证实验的稳定性。3.有机营养成分：包括人工合成或天然的有机附加物（包括维生素，氨基酸及其它有机物质等）。最常用的有酪朊水解物(水解乳蛋白、水解酪蛋白CH)、酵母提取物、玉米胚乳、麦芽浸出物、西红柿汁、椰子汁(CM)及各种氨基酸如甘氨酸（氨基乙酸）等。维生素：在培养基中加入维生素，常有利于外植体的发育。培养基中的维生素属于B族维生素，其中效果最佳的有硫氨素（维生素B1）、盐酸吡哆醇（维生素B6）和维生素H（生物素）、泛酸钙等、肌醇（环己六醇）、烟酸。在部分培养基中还添加维生素BX（氨酰苯甲酸）、维生素C（抗坏血酸）、维生素E（生育酚）、、维生素B12（氰钴胺酸）、维生素BC（叶酸）、维生素B2（核黄素）和氯化胆碱等维生素。这些可能对某些植物或植物的某些代谢过程有重要作用，如肌醇主要以磷酸肌醇和磷脂酰肌醇的形式参与由Ca介导的信号转导。4.生长调节物质（常称为激素）常用的生长调节物质大致包括以下三类：(1)植物生长素类。主要作用是：诱导愈伤组织的产生，促进细胞脱分化；促进细胞的伸长；促进生根。如吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、IBA（吲哚丁酸）、NOA（萘氧乙酸），P-CPA（对氯苯氧乙酸）、2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸），2，4，5-T（2，4，5-三氯苯氧乙酸）和ABT生根粉等。生长素的使用浓度通常为0.1～10mg/L。(2)细胞分裂素。如玉米素（Zt，6-（4-羟基-3-甲基-反式-2-丁烯氨基）嘌呤）、6-苄基嘌呤（6-BA或BAP）和激动素（Kt，6-呋喃氨基嘌呤）、2IP（异戊烯氨基嘌呤）和TDZ（thidiazuron,噻二唑苯基脲）等。作用主要是：第一，促进细胞分裂和扩大(与生长素促进细胞伸长的作用不同)，可使茎增粗，而抑制茎伸长；第二，诱导芽的分化，促进侧芽萌发生长；第三，抑制衰老，减少叶绿素的分解。延缓离体组织或器官的衰老过程，有保鲜的效果。但是，细胞分裂素对根的生长一般起抑制作用。在组培中，细胞分裂素的使用浓度通常为0.1～10mg／L。细胞分裂素常常与生长素相互配合，用以调节细胞分裂，细胞伸长，细胞分化和器官形成。(3)赤霉素。组织培养中使用的赤霉素只有一种，即赤霉酸（GA3）。虽然已经用于顶端分生组织的培养和维管分化的研究，但在培养基中很少添加，因为它的作用往往是负面的。乙烯等。5.琼脂或其他支持物除液体悬浮培养外，就目前情况而言，琼脂是一种极为理想的支持物。一般浓度0.4%-1%，质量越差的琼脂用量越大。琼脂作为培养基的支持物，使培养基呈固体状态，以利于各种外植体的培养。6.其他添加剂（含天然提取物、抗生素等）活性炭渗透调节剂抗生素抗氧化剂等。活性炭加入培养基中的目的主要是利用其吸附能力，减少一些有害物质的影响，例如防止酚类物质污染而引起组织褐化死亡。这在兰花组织培养中效果更明显。另外，活性炭使培养基变黑，有利于某些植物生根。但活性炭对物质吸附无选择性，既吸附有害物质，也吸附有利物质，因此使用时应慎重考虑，不能过量，一般用量为1%—5％。活性炭对形态发生和器官形成有良好的效应。在失去胚状体发生能力的胡萝卜悬浮培养细胞中加入1％一4%活性炭可使胚状体的发生能力得以恢复。7.水水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止储藏过程发霉变质。大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。8.pH培养基的pH因培养材料不同而异，大多数植物都要求在pH5.6—5.8的条件下进行组织培养。常用0.1mol/L的Na0H和0.1mol/L的HCl来调节培养基的PH。但需注意两点：第一，经高温高压灭菌后，培养基的PH会下降0.2—0.8，故调整后的PH应高于目标pH0.5个单位；第二，pH的大小会影响琼脂的凝固能力，一般当pH大于6.0时，培养基将会变硬，低于5.0时，琼脂就不能很好地凝固。培养基种类：根据培养基态相不同分为固体培养基与液体培养基。固体培养基是指加凝固剂(多为琼脂)的培养基，其优点是外植体只是部分接触培养基，因此会使培养基中的效应物质产生一定的浓度梯度，从而有利于外植体的分化、生长。液体培养基是指不加凝固剂的培养基。外植体在液体培养基中能够与效应物质更好地接触，因此，生长速度比在固体培养基中更快。根据培养物的培养过程，培养基分为初代培养基与继代培养基。初代培养基是指用来第一次接种外植体的培养基。继代培养基是指用来接种继初代培养之后的培养物的培养基。根据其作用不同，培养基分为诱导培养基、增殖培养基和生根培养基。根据其营养水平不同，培养基分为基本培养基和完全培养基。基本培养基(就是通常称呼的培养基)主要有MS、White、B5、N6、改良MS、Heller、Nitsh、Miller、SH等。完全培养基就是在基本培养基的基础上，根据试验的不同需要，附加一些物质，如植物生长调节物质和其他复杂有机附加物等。组织培养培养基配制：选择合适的培养基是植物组织培养成功的基础。选择合适的培养基主要从以下两个方面考虑：一是基本培养基；二是各种激素的浓度及相对比例。MS培养基适合于大多数双子叶植物，B5和N6培养基适合与许多单子叶植物，特别是N6培养基对禾本科植物小麦、水稻等很有效，White培养基适合于根的培养。①根据配方要求，用量筒或移液管从每种母液中分别取出所需的用量，放入同一烧杯中，并用粗天平称取蔗糖、琼脂放在一边备用。②将①中称好的琼脂加蒸馏水300～400毫升，加热并不断搅拌，直至煮沸溶解呈透明状，再停止加热。③将①中所取的各种物质（包括蔗糖），加入煮好的琼脂中，再加水至1000毫升，搅拌均匀，配成培养基。④用1N的氢氧化钠或盐酸，滴入③中的培养基里，每次只滴几滴，滴后搅拌均匀，并用pH试纸测其pH值，直到将培养基的pH值调到5.8。⑤将配好的培养基，用漏斗分装到三角瓶（或试管）中，并用棉塞塞紧瓶口，瓶壁写上号码。瓶中培养基的量约为容量的1/4或1/5。培养基的成分比较复杂，为避免配制时忙乱而将一些成分漏掉，可以准备一份配制培养基的成分单，将培养基的全部成分和用量填写清楚。配制时，按表列内容顺序，按项按量称取，就不会出现差错。组织培养培养基的灭菌与保存培养基配制完毕后，应立即灭菌。培养基通常应在高压蒸汽灭菌锅内，在汽相120℃条件下，灭菌20分钟。如果没有高压蒸汽灭菌锅，也可采用间歇灭菌法进行灭菌，即将培养基煮沸10分钟，24小时后再煮沸20分钟，如此连续灭菌三次，即可达到完全灭菌的目的。经过灭菌的培养基应置于10℃下保存，特别是含有生长调节物质的培养基，在4～5℃低温下保存要更好些。含吲哚乙酸或赤霉素的培养基，要在配制后的一周内使用完，其它培养基最多也不应超过一个月。在多数情况下，应在消毒后两周内用完。组织培养中几种常用培养基的配方化合物MS(1962)White(1943)N6(1974)B5(1968)Heller(1953)Nitsh(1972)Miller(1967)SH(1972)NH4NO316501000KNO319008028302527.510002500(NH4)2SO4463134NaNO3600KCl6575065CaCl2.2H2O44016615075166200Ca(NO3)2.4H2O300347MgSO4.7H2O370720185246.525018535400Na2SO4200KH2PO417040068300K2HPO4300FeSO4.7H2O27.827.827.8515Na2.EDTA37.337.337.7520Na-Fe-EDTA28FeCl3.6H2OFe(SO4)32.5MnSO4.4H2O22.374.4100.01254.4ZnSO4.7H2O8.631.521101.5Zn(螯合物)0.0310NiCl2.6H2O1.0CoCl2.6H2O0.025CuSO4.5H2O0.025AlCl3MoO3Na2MoO4.2H2O0.25TiO21.0KI0.830.750.80.750.01101.65.0H3BO36.21.51.631NaH2PO4.H2O16.5150125烟酸0.50.50.515.0盐酸吡哆素VB60.50.10.511.05.0盐酸硫胺素VB10.10.11100.5肌醇100100100100甘氨酸232培养基配方B5培养基(Gamborg等,1968)(1)无机物NaH2PO4·H2O150mg/L；KNO33000mg/L；(NH4)2SO4134mg／L；MgSO4·7H2O500mg/L；Na2一EDTA37.3mg/L；FeSO4·7H2O27.8mg/L；MnSO4·H2O10mg/L；ZnSO4·7H2O2mg/L；H3BO33mg/L；Na2MoO·2H2O0.25mg/L；CuSO4·5H2O0.025mg/L；CoCl2·6H200.025mg/L；KI10mg/L。(2)有机物维生素B110mg/L；维生素B61mg/L；甘氨酸2.0mg/L；叶酸0.5mg/L；肌醇100.0mg／L；蔗糖50g／L；pH5.5。B5培养基是1968年由Gamborg等设计的。它的主要特点是含有较低的铵盐，较高的硝酸盐和盐酸硫胺素。铵盐可能对不少培养物的生长有抑制作用，但它适合于有些植物如双子叶植物特别是木本植物的生长。HB培养基Holley&Baker(1963)(1)无机盐(以1/2浓度的Knop液为基础)Ca(NO3)2.4H2O1000mg/L；KNO3125mg/L；MgSO4·7H2O125mg/L；KH2PO4125mg/L；Berthelot's液0.5ml/L。Berthelot's液成分组成:MnSO4·4H2O20g/L，KI0.5g/L，NiCl2·6H200.05g/L，CoCl2·6H200.05g/L，ZnSO4·7H200.10g/L，CuSO4·5H2O0.05g/L，BeSO4·4H2O0.10g/L，H3BO30.05g/L，浓硫酸1ml。(2)有机物维生素B1理学1mg/L；腺嘌呤8mg/L；NAA2mg/L；蔗糖40g／L。H培养基(1)无机盐KNO3950mg/L；NH4N03720mg／L；MgSO4·7H2O185mg/L；CaCl2·2H2O166mg/L；KH2PO468mg/L；Na2一EDTA37.3mg/L；FeSO4·7H2O27.8mg/L；MnSO4·4H2O25mg/L；ZnSO4·7H2O10mg/L；H3BO310mg/L；Na2MoO·2H2O0.25mg/L；CuSO4·5H2O0.025mg/L；(2)有机物维生素B10.5mg/L；维生素B60.5mg/L；甘氨酸2.0mg/L；叶酸0.5mg/L；肌醇100.0mg／L；烟酸0.5mg/L；生物素0.05mg/L；蔗糖20g／L；pH5.5。Kassanis培养基(1957