毕赤酵母产木聚糖酶实验方案

毕赤酵母简介甲醇营养型毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统是80年代初被开发和研制的一种新型酵母表达系统。40年前，Ogata等人首次发现有些酵母能够利用甲醇作为唯一的碳源和能源进行生长。随后，甲醇营养酵母作为潜在的单细胞蛋白(singlecellprotein,SCP)来源立即引起广泛关注，最初将其作为高蛋白的动物饲料在市场上销售。在20世纪70年代，PhillipsPetroleum公司开发出毕赤酵母利用甲醇生长的培养基、发酵操作手册和高密度连续培养生产工艺[2]。70年代的石油危机导致了甲烷价格的急剧上升，与此同时，动物饲料蛋白的主要替代源——大豆价格的下降，导致利用甲醇生产SCP在经济上已不再合适。在以后的10年中，PhillipsPetroleum公司与SIBIA公司合作开发利用毕赤酵母作为生物体表达外源蛋白的研究，研究人员分离了醇氧化酶(alcoholoxidase,AOX)的基因和启动子，构建了表达载体和菌株，开发了毕赤酵母基因操作相关技术。成熟的SCP发酵方法的开发，加上醇氧化酶强启动子的可调控表达特性，极大地影响着外源蛋白在毕赤酵母中的高水平表达。1993年，PhillipsPetroleum公司委托Invitrogen公司代理毕赤酵母表达系统产品。毕赤酵母能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX——甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30％。而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX。AOX的合成是在转录水平调控的。其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导又重机制控制的。外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达。巴斯德毕赤酵母中存在着一种称为微体的细胞器，其中大量合成过氧化物酶，因此也称为过氧化物酶体。与大肠杆菌等原核表达系统相比，毕赤酵母作为一种低等真核生物，除了具有遗传操作简单、细胞生长快、易于培养等原核生物的特点外，又具有真核生物完整的蛋白表达、正确加工和修饰功能，能有效克服大肠杆菌系统表达蛋白过程中存在的不足；而与高等哺乳动物细胞相比，又具有产量高、培养成本低、产物的分离纯化简单等优点。因此，毕赤酵母表达系统因其具有表达效率高、外源基因遗传稳定、易实现高密度培养、产物可分泌和蛋白翻译后加工等众多其它表达载体所无法比拟的优点，已成为近年来极受青睐的外源蛋白表达宿主，受到越来越多的重视和利用。截止2005年，已有500多种外源蛋白通过毕赤酵母表达系统得到克隆表达，这些外源蛋白产品涉及食品、饲料、纺织和医药品等关系国计民生的多个行业。然而，要实现众多新的外源蛋白产品在工业发酵罐水平下大规模商业化生产，除了构建高效、稳定的毕赤酵母生产菌株外，利用过程控制的方法和手段，最大限度地提高生物反应器中基因工程菌的总生物量，发挥菌种的最大生产潜力，提高单位体积培养液中目标蛋白的表达水平是实现大规模、商业化重组蛋白生产、提高生产效率的一个关键因素。毕赤酵母生产表达外源蛋白的发酵过程一般而言，毕赤酵母高密度流加培养生产表达外源蛋白过程由甘油分批培养、甘油流加培养和甲醇诱导表达三个不同阶段构成。甘油分批培养的目的是为了积累一定的生物量，同时抑制AOX启动子及外源蛋白表达；甘油流加培养是通过限制性的甘油流加，进一步增加生物量，尽可能地获得高细胞浓度，同时解除过量甘油对AOX启动子的抑制作用，为细胞进入诱导期作准备；甲醇诱导表达阶段是通过添加诱导剂甲醇，实现AOX高水平转录和外源蛋白的高效表达。木聚糖简介木聚糖（xylan）为多聚五碳糖，是半纤维素的一种，广泛存在于植物细胞壁中，是自然界含量仅次于纤维素的碳水化合物。木聚糖的结构单元是木糖，通过木糖苷键连接的木糖长链成为主链，在主链上部分基团被侧链基团取代，这些侧链基团有乙酰基、阿拉伯糖基、半乳糖基、葡萄糖醛酸基、香豆酸、阿魏酸等，木聚糖再通过侧链基团与植物的其余成分如纤维素、木质素、果胶相连接形成致密的结构，共同构成了植物体的支持骨架。毕赤酵母产木聚糖酶摇瓶实验方案培养基组成：种子培养基(g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨20。甘油生长培养基(g/L)：甘油20mL/L，MgSO41，K2SO41，(NH4)2SO45，CaSO40.1，H3PO42%(v/v)，PTM110mL/L，KOH20，pH6.0。甲醇诱导培养基(g/L)：甲醇10mL/L，MgSO41，K2SO41，(NH4)2SO45，CaSO40.1，H3PO42%(v/v)，PTM110mL/L，KOH20，pH6.0。PTM1组成(g/L)：CuSO4·5H2O6g，NaI0.08g，MnSO4·H2O3g，Na2MoO40.2g，H3BO30.02g，CoCl20.5g，ZnCl220g，FeSO4·7H2O65g，H2SO45mL，生物素0.2g具体实验操作步骤如图1：菌株培养皿活化（30°C，2-3d）250mL摇瓶种子培养（30°C，220rpm，24h）每瓶种子培养基体积25mL250mL摇瓶甘油生长培养（30°C，220rpm，24h）每瓶甘油生长培养基体积25mL250mL摇瓶甲醇诱导培养（30°C，220rpm）每瓶甘油生长培养基体积25mL挑取活化后菌株于种子培养基以10%接种量吸取2.5mL活化种子培养液于甘油生长培养基离心（2000rpm×2min）收集菌体，将菌体转入等体积诱导培养基中进行诱导培养每12h取样检测菌体浓度、离心（8000rpm×5min）后测上清液木聚糖活性；每24h补加一次甲醇；诱导培养共72h（3d）发酵结束，清洗实验仪器，撰写实验报告图1毕赤酵母产木聚糖酶摇瓶实验操作流程图木聚糖酶活性的检测方法：