氧自由基对肿瘤的影响

1]孔德升.组织因子途径抑制物-2及其结构域1的基因克隆、表达和功能研究[D].复旦大学,2006.组织因子途径抑制物一2(tissuefactorpathwayinhibitor-2，TFPI-2)，又称胎盘蛋白一5(placentaprotein-5，PP-5)和基质相关丝氨酸蛋白酶抑制剂(matrixassociatedserineproteaseinhibitor,MSPI)，是一种带有kunitz型结构域的蛋白酶抑制剂，属于丝氨酸蛋白酶抑制物超家族成员，由于与组织因子途径抑制物(tissuefactorpathwayinhibitor,TFPI)的结构非常相似，故此得名。成熟的人TFPI-2(humanTFPI-2，hTFPI-2)由富含酸性氨基酸的N端、串联的三个kunfiz结构域和富含碱性氨基酸的C端组成，体外实验发现它能抑制胰蛋白酶、纤溶酶、糜蛋白酶、血浆缓激肽释放酶、胰凝乳蛋白酶、组织蛋白酶G等多种蛋白酶的活性，但对凝血因子Vna(FVIIa)／组织因子(tissuefactor,TF)复合物、凝血因子Xa(FXa)、t-PA(tissue-typeplasminogenactivator)及uPA(urokinase-typevlasminogenactivator)的抑制作用不明显。已知TFPI的三个结构域有其各自的功能，如结构域1与FVIIa／TF结合并抑制其功能；结构域2与FXa结合并抑制其功能；结构域3与肝素、CDl4、LRP(10Wdensitylipoproteinreceptor-relatedprotein，LRP)和gp330结合，发挥抗炎、协助抗凝、促进TFPI代谢等作用。从理论上推测，hTFPI-2既然与TFPI结构类似，它的三个结构域也应该具有独立的功能，但这些功能是什么则需要大量的实验证实。研究表明hTFPI-2能够抑制乳腺癌、前列腺癌、肺癌、纤维肉瘤、黑色素瘤、胶质细胞瘤等多种恶性肿瘤的侵袭转移，也能够抑制动脉粥样硬化斑块的脱落。因此，hTFPI-2有可能作为一种新型蛋白质药物，在治疗肿瘤转移和动脉粥样硬化并发症方面具有潜在的应用前景。但是，TFPI-2的生理功能迄今未知，极大地妨碍了它的应用。由于TFPI-2是一种存在于细胞外基质中的蛋白酶抑制因子，对于细胞外基质的重塑发挥重要的调节作用，因此人们认为TFPI-2可能和细胞运动、胚胎发育、伤口愈合、肿瘤转移和动脉粥样硬化等生理病理过程具有密切的关系。应用分子生物学技术在模式生物中定向敲除(knockout)某个特定基因，然后观察实验动物的整体结构、功能和生理状态的变化，已成为研究基因功能的重要方法。因此，鉴于TFPI-2的研究现状，有必要采用模式生物详细研究TFPI一2的生理功能，从而对该蛋白的理论研究和应用开发提供更多的理论知识。我们以人胎盘组织总RNA为模板，用RT-PCR获得hTFPI-2的cDNA基因，通过与原核表达载体重组，实现了hTFPI-2在大肠杆菌中的高效表达，目的蛋白以包涵体形式存在于菌体内，表达量占全菌总蛋白的20％一30％，经复性、纯化后hTFPI-2的纯度大于90％，产率约为20-30mg／L。性质研究表明复性后的hTFPI-2具有抑制胰蛋白酶、纤溶酶、MMP-2和MMP-9的活性，同时亦具有抑制纤维肉瘤细胞HT-1080侵袭转移的能力。本研究还探索了采用酵母表达系统制备hTFPI-2第一个Kunitz结构域(hTFPI-2／KD)的工艺路线，并在此基础上研究了hTFPI-2／KDl的功能和结构。研究初期，我们按常规方法把hTFPI-2／KDl的野生型基因转入毕赤酵母体内，但表达结果并不理想。在分析了hTFPI-2／KDl编码序列的特点之后，我们发现其中含有较多的酵母稀有密码子，因此推测密码子的偏好性可能是制约该蛋白在酵母体内表达的原因之一。我们利用PCR的方法按照毕赤酵母密码子使用的偏好性优化了hTFPI-2／KDl的编码基因，将其与毕赤酵母表达载体pPIC9K重组，用电转化的方法使重组质粒转入毕赤酵母体内，筛选出高拷贝的转化子。种子菌经两次放大后，在30L发酵罐中用甲醇诱导表达，诱导40小时后目的蛋白表达量达到高峰，并且以可溶形式存在于培养上清中。培养上清依次经超滤、分子筛、离子交换等纯化步骤进行纯化。纯化后的目的蛋白纯度达到96％，产量为20mg/L左右。发色底物法检测显示，hTFPI-2／KDl对纤溶酶和胰蛋白酶都具有明显的抑制作用。应用明胶酶谱法观察到hTFPI-2／KDl对MMP-2和MMP-9均具有抑制作用；Matrigel法观察到hTFPI-2／KDl能够降低纤维肉瘤细胞HT-1080的体外侵袭能力。我们联合应用斑马鱼基因组数据库、生物信息学、RT-PCR和RACE等方法率先克隆了zebrafishTFPI-2(zTFPI-2)的cDNA序列。经过序列分析发现zTFPI-2同样具有三个串联排列的Kunitz结构域，与人TFPI-2的三个结构域的同源性分别为59％、65％和5l％。在此基础上，我们采用斑马鱼胚胎整体原位杂交技术(wholemountmsimhybridization)观察了zTFPI一2在斑马鱼胚胎发育过程中表达的时间和空间变化，发现zTFPI-2在斑马鱼胚胎发育的早期阶段就有明显的表达，杂交信号主要存在于胚胎的头部和双侧胸鳍，实时定量PCR显示zTFPI-2的表达水平在成鱼各脏器中依次为脑部、心脏、肝、眼和卵巢，初步提示zTFPI-2和这些脏器的功能或发育可能有比较密切的关系。为观察zTFPI-2在斑马鱼胚胎发育过程中的作用，我们根据它的基因序列设计了吗啡琳修饰的反义核酸，采用显微注射的方法将其注入到斑马鱼受精卵内，使zTFPI-2的表达下调。结果显示，zTFPI-2下调的斑马鱼胚胎出现头部变小、卵黄囊增大、心包水肿、中枢神经系统中的神经纤维明显稀疏、眼底感光细胞排列紊乱等变化，同时伴有双侧胸鳍的发育显著减缓。为了进一步研究其中的分子机制，我们采用基因芯片比较了正常和zTFPI-2下调后的胚胎之间基因表达谱的变化，发现zTFPI-2下调后有近六百个基因发生了两倍以上的上调或下调。这些基因涵盖了结构分子、酶类、第二信使分子、转录因子等的编码基因，其中与胚胎发育尤其是中枢神经系统发育关系比较密切的是Notch信号通路中的某些信号分子，如Notchla、mib和her4，Real-timePCR也证实了这些信号分子的确下调。这些结果为下一步研究TFPI-2影响胚胎发育的具体机制指明了方向。[2]王莲.原子氧自由基阴离子诱导的微生物失活及材料表面改性研究[D].中国科学技术大学,2007.本论文利用原子氧自由基阴离子(O'-)的强氧化性和反应性特点，结合我们研发的O'-储存发射材料(C12A7-O'-)以及高纯度O'-制备方法，首次开展了(1)原子氧自由基阴离子诱导的微生物失活和相互作用机理研究；(2)原子氧自由基阴离子诱导的聚合物表面改性及其机理研究；(3)原子氧自由基阴离子诱导的硅片表面氧化和二氧化硅薄膜形成研究。研究结果表明，O'-和O'-储存发射材料在微生物失活、聚合物材料改性和氧化硅薄膜制备等领域具有重要的潜在应用价值。本论文的主要研究内容与结果包括：1.原子氧自由基阴离子诱导的微生物失活和相互作用机理研究1)高纯原子氧自由基阴离子束的产生：C12A7-O'-材料是一种具有储存、发射原子氧自由基阴离子(O'-)的功能材料，我们利用等离子镀膜技术，将该材料镀在镶嵌有加热丝的陶瓷支撑体表面，制成O'-发生器。研究结果表明，由该O'-发生器产生的最大O'-束强度为220μA，发射的O'-束纯度大于90％。2)O'-水溶液的制备与表征：利用氩气为载气，将O'-发生器产生的O'-离子通入去离子水中制成O'-水溶液；形成的O'-水溶液一般呈酸性，利用电子顺磁共振(EPR)和紫外一可见分光光度计(UV-VIS)等表征方法，测量了O'-水溶液中O'-和H,2O,2等活性氧物种的浓度。3)气相原子氧自由基阴离子的微生物失活和机理研究：利用由O'-发生器产生的高纯O'-束，研究了气相原子氧自由基阴离子诱导的微生物失活和机理。主要考察了O'-束强度、处理温度、微生物初始浓度等对微生物失活效果的影响以及细胞结构的变化。结果表明，1.5μA/cm'2O'-束在120min内可以引起3个对数量级以上的微生物数目的减少，失活效率随O'-束强度、处理温度的增加而增加；微生物初始浓度对失活效率没有显著性影响；O'-束诱导的不同种类的微生物的失活效果不同，与微生物的结构有关。场发射扫描电镜(FESEM)、四极质谱(Q-MS)和时间飞行质谱(TOF-MS)结果显示大肠杆菌的细胞壁和细胞膜被O'-破坏，同时在失活过程中有CO和CO,2产物生成。4)O'-水溶液中微生物失活和机理研究：在不同条件下，考察了大肠杆菌在O'-水溶液中的失活过程，探讨了失活机理。结果表明，在60min内，O'-水溶液[pH4.30±0.20，(2.5±0.8)×10'-2mmol/lO'-；0.5±0.2mmol/lH,2O,2]可以使大肠杆菌的数目减少3个对数量级；在15-45℃的温度范围内，失活效率随温度的增加而增加；大肠杆菌的初始浓度升高，失活效率降低。O'-水溶液诱导的大肠杆菌失活过程中，存在大肠杆菌细胞的脂质过氧化反应，并出现核酸泄漏现象，FESEM观察发现细胞壁破损。因此，O'-诱导的细胞壁和细胞膜破损以及核酸泄漏可能是大肠杆菌死亡的潜在原因。2.原子氧自由基阴离子诱导的聚合物材料表面改性及其机理研究1)O'-水溶液对聚苯乙烯的表面改性研究：以O'-水溶液(0.03±0.01mmol/lO'-；0.5±0.1mmol/lH,2O,2)为反应液，研究了在常温下O'-水溶液对聚苯乙烯表面改性效果。利用接触角仪、原子力显微镜(AFM)、FESEM、X射线光电子能谱仪(XPS)、全反射傅立叶红外变换光谱仪(ATR-FTIR)等表征手段对改性后表面亲水性、粗糙度、表面形貌及表面物种进行了详细地分析。结果表明，O'-水溶液在48小时内使聚苯乙烯的接触角降低10°，引起表面能和亲水性提高；O'-水溶液改性后的表面变粗糙，引入了新的OH和C=O等亲水官能团。亲水官能团的引入是表面亲水性提高的原因。2)O'-水溶液对聚四氟乙烯的表面改性研究：O'-水溶液处理后的聚四氟乙烯表面有C-O，C-F和CF,3等新官能团生成，表明O'-引起了聚四氟乙烯表面化学键的断裂和氧化，同时未发现诸如C=O和OH等亲水官能团生成。常温下O'-水溶液处理48小时可使聚四氟乙烯表面的接触角提高14°，引起表面能和亲水性降低，疏水性提高。FESEM结果显示，O'-水溶液改性后的聚四氟乙烯表面变粗糙，这可能是表面疏水性提高的原因。3.原子氧自由基阴离子诱导的硅片表面氧化和二氧化硅薄膜形成研究利用O'-束对硅片表面氧化和二氧化硅薄膜形成过程进行了研究，并且由O'-氧化的硅片制备了金属一氧化物一半导体(MOS)电容器，测试了电容器的电学特性。[3]赵娥.原子氧自由基阴离子诱导的聚氯乙烯表面改性及大肠杆菌失活的研究[D].中国科学技术大学,2008.本论文利用原子氧自由基阴离子(O'-)的强氧化性和反应性特点，结合我们研发的O'-储存发射材料(C12A7-O'-)以及高纯度O'-制备方法，制备了原子氧自由基阴离子(O'-)溶解的水溶液(O'-水)，首次开展了(1)原子氧自由基阴离子诱导的聚氯乙烯材料表面改性的研究；(2)原子氧自由基阴离子诱导的大肠杆菌失活的初步研究。研究结果表明，O'-和C12A7-O'-材料在聚合物材料改性和微生物失活等领域具有重要的潜在应用价值。本文的主要研究内容与结果包括：1.原子氧自由基