水中细菌总数及大肠菌群的同时测定实验方案MicrosoftWord文档

福建医科大学人工湖水体中——细菌总数及大肠菌群数的检测实验方案实验组员：陈秋香、陈志明、林玲、李淋、管修标一、实验目的1．学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。2．了解水的平板菌落计数的原则。3.掌握测定水中大肠菌群数量的多管发酵法的原理、操作步骤及方法；4.了解水质评价的微生物学卫生标准，明白其应用的重要性。二、实验原理A．水中的细菌总数越多，说明水中有机物的含量就越高，水体被污染的程度越重。水中细菌的种属繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中的细菌的总数实际上是一种近似值。肠道中的绝大多数腐生性和致病性的细菌，可在牛肉膏蛋白胨培养基上进行生长。因此应用平板菌落计数技术来测定水样中的细菌总数基本上能代表水样中细菌的数量。B.总大肠菌群是以E.coli为代表的杆状、无芽胞、需氧或兼性厌氧、革兰氏阴性，经37℃、24～48h培养，发酵乳糖产酸产CO2可区别于其他肠道菌，易于测定的一类细菌。大肠菌群主要包括埃希氏菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属和柠檬酸杆菌属。这类菌是温血动物肠道中的正常菌群，常随动物的粪便污染水源，一个成年人每天排出的粪便中含有（5-100）×1010个这类细菌，并且它们与水中存在的肠道病原菌呈正相关性，而病原菌在水中的浓度很低，测定手续繁琐，工作人员还有被感染传播的危险。因此，总大肠菌群是一个合适的指示菌，能指示出病原菌在水中的存在，其数量大于或等于病原菌的数量，并且比病原菌容易检出，所以检测水的细菌学卫生标准，通常检测总大肠菌群。三、实验器材及试剂1.菌落总数恒温培养箱、高压蒸气锅、电子天平、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；灭菌的玻璃塞瓶1个，三角烧瓶/烧杯4个，灭菌培养皿9个，1ml移液管6支、10ml2支、试管3支，PH试纸、玻璃棒、记号笔1支,100ml量筒，滴管2支。2.大肠菌群仪器及用具：高压蒸气锅、恒温培养箱、显微镜（载玻片一盒、擦镜纸、双层瓶含香柏油和二甲苯）打火机、酒精灯、接种环、无菌1ml吸管8支、10ml4支，发酵用试管10支、杜氏小管10个，烧杯/蒸馏瓶5个，100ml量筒、滴管若干，PH试纸、玻璃棒、电子台秤。培养基：乳糖蛋白胨半固体培养基，三倍浓乳糖蛋白胨培养液，伊红美蓝培养基，革兰染色剂，生理盐水等。四、操作步骤1．水样的采取取距湖水面10-15cm深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。2．细菌总数测定（a）取加入9ml水的灭菌试管。取1ml水样注入第一管9ml灭菌水内，摇匀，再自第一管取1ml至下一管灭菌水内，如此稀释到第三管，稀释度分别为10-1、10-2与10-3。一般中等污秽水样，取10-1、10-2、10-3三个连续稀释度，污秽严重的取10-2、10-3、10-4三个连续稀释度。（b）自最后一个稀释度的试管中各取1ml稀释水加入空的灭菌培养皿中，每一稀释度做两个培养皿。（c）各倾注15ml已溶化并冷却至45℃左右的培养基，立即放在桌上混匀。（d）凝固后倒置于37℃培养箱中培养24小时。3.大肠菌群数的测定a.初发酵试验：分别吸取1mL1:10稀释水样、1mL1:100稀释水样及1mL水样，分别注入装有10mL普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管）。另取10mL水样，注入装有5mL3倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管）。混匀后，37℃培养24h。b.平板分离：经24h培养后，将产酸产气及只产酸不产气的发酵管，分别划线接种于伊红美蓝琼脂培养板上，再于37℃下培养18～24h，将符合下列特征菌落：深紫黑色，具有金属光泽；紫黑色，不带或略带金属光泽；淡紫红色，中心颜色较深，挑取其中的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。c.复发酵试验：上述涂片镜检如为革兰阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分，再接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液的6支试管中（内有倒管）。每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1～3个，37℃培养24h，试验结果若产酸产气，即证实有大肠菌群存在。证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管数查表，即得总大肠菌群。水样五、计算结果1.湖水中细菌总数a.细菌总数的菌落计数方法（1）先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个培养皿有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的培养皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到培养皿的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全培养皿的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。（2）首先选择平均菌落数在30—300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数（见表ⅪⅤ-1）。（3）若有两个稀释度，其平均菌落数在30—300之间，则应按两者菌落数以各自稀释倍数后的总数之比（稀释度高的数/稀释度低的数）来决定。若其值小于2，应报告两个总数的平均数（若大于等于2则报告其中较少的菌落总数）（4）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数。（5）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。（6）若所有稀释度的平均菌落数均不在30—300之间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数。（7）若所以稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。（8）菌落计数的报告：菌落计数在100以内按实际数报告，大于100，采用二位数计数，在二位数有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩减数字后面的零数，也可以用10的指数来表示。在报告菌落数为“多不可计”时，应注明水样的稀释倍数。六.实验报告1．细菌总数结果2.大肠菌群数的测定——根据实验的阳性结果，查表可知。注意事项：•1.认真配制不同类型的培养基•2.检测中应合理控制所加的水样量。•3.在选菌落时认真选择大肠菌群典型菌落。•4.操作过程中注意避免污染。设备及仪器：1.细菌总数测定恒温培养箱、高压蒸气锅、电子天平、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；灭菌的玻璃塞瓶1个，三角烧瓶/烧杯4个，灭菌培养皿9个，无菌1ml吸管6支、10ml2支、试管3支，PH试纸、玻璃棒、记号笔1支,100ml量筒，滴管2支。营养琼脂200ml成为：蛋白胨2g；牛肉膏0.6g；氯化钠1g；琼脂4g；蒸馏水400ml（200ml配置培养基）。2.大肠菌群数的测定无菌1ml吸管6支、10ml4支，发酵用试管10支、杜氏小管10个，烧杯/蒸馏瓶5个，100ml量筒、滴管若干，PH试纸、玻璃棒。显微镜（载玻片一盒、擦镜纸、双层瓶含香柏油和二甲苯）打火机、酒精灯、接种环，培养皿6个。烧杯/蒸馏瓶5个，试剂瓶若干等。培养基：乳糖蛋白胨半固体培养基200ml成分：蛋白胨2g，牛肉膏0.6g，乳糖1g，氯化钠0.2g，1.6﹪溴甲酚紫乙醇溶液0.2ml，蒸馏水200ml；三倍浓乳糖蛋白胨培养液10ml：蛋白胨0.3g，牛肉膏0.09g（取0.1g），乳糖0.15g，氯化钠0.15g，1.6﹪溴甲酚紫乙醇溶液0.03ml，蒸馏水10ml。伊红美蓝培养基100ml成分：蛋白胨1.0g，乳糖1.0g，磷酸氢二钾0.2g，琼脂1.7g，2％伊红水溶液，0.65％美蓝溶液1ml，蒸馏水100ml。革兰染色所需试剂：（1）结晶紫染色液10ml成分：将2ml结晶紫乙醇饱和溶液（称取0.4—0.8g结晶紫溶于10ml95﹪乙醇中）和8ml1﹪草酸铵溶液混合、过滤。（2）助染剂：将0.11g碘与0.2g碘化钾混合后，加入少许蒸馏水，充分震荡，待完全溶解后，可用蒸馏水补充至30ml，临用前再加水稀释。（3）95％乙醇50ml（4）复染剂：将0.25g沙黄加入到10ml95％乙醇中，待完全溶解后，加入90ml蒸馏水。（5）生理盐水10ml