水曲柳复壮机理的研究11月份总结

组织培养过程中水曲柳复壮机理的研究任小龙•1、构建水曲柳抑制消减文库（SSH）•2、基因克隆•3、基因的转化和功能预测MRNA的提取，分离提纯，依照说明书进行。SSH具体操作依照说明书进行差减cDNA文库的构建差示筛选差减DNA文库Northern杂交分析cDNA片段的测序和DNA序列分析相关基因的克隆转化总RNA的提取与mRNA的分离纯化构建水曲柳抑制消减文库•1构建目的：分离两个mRNA群体间差异表达基因。•2.构建方法：1接头••Tester——过量Driver第一次杂交Driver二次杂交••2接头2RNA2cDNA2cDNA片段1接头2接头Driver酶切——过量Tester第一次杂交Tester二次杂交差异表达cDNA大量富集克隆转化，建立文库。抑制性差减杂交PCR法（SSH）•1）第1次杂交。提取TS和RS的mRNA反转录为testercDNA和drivercDNA，用RsaI或Hae!酶切成平头末端cDNA，分成均等2份，分别加不同的接头，再分别与过量的drivercDNA杂交，将形成4种产物：a，单链testercDNA、b，自身退火的tester/tester双链、c，异源退火tester/driver双链、d,drivercDNA。•2）第2次杂交。合并2份杂交产物，加入新的变性drivercDNA退火、杂交，这次除了a、b、c、d4种产物外还形成产物e，e是tester自身退火形成，但两端带不同接头。•3）特异性片段的扩增。末端补平后，先后加接头的内、外侧引物扩增，a和d无扩增，b由于两端接头互补形成发夹结构也无扩增，c仅一端有引物结合呈线性扩增，仅e两端可配不同引物而呈指数扩增。•4）特异性片段e克隆，并进一步分离差异表达基因。该法通过2次杂交和2次PCR，使假阳性率降到6%，且灵敏度高。用SSH可一次同时分离几十至几百个差异基因，使效率大增。但由于SSH需mRNA量大（几微克），对mRNA来源困难的材料不利。因为SSH对不同材料或材料间存在小片段缺失不能有效检测，所以研究材料的差异不能太大。SSH主要集中在肿瘤基因的克隆上，也有用于细胞凋亡研究的。•（1）水曲柳生理成熟态与生理幼态抑制消减杂交文库（SSH）的构建和测序•分别取两种不同材料，提取RNA并反转录成cDNA，利用RsaI对cDNA进行酶切，产生平末端cDNA片段。将TestercDNA片段平均分成两份，分别加上不同的接头。用过量的Driver样品分别与两份加了不同接头的Tester样品进行第一次消减杂交，将两组杂交样品混合，同时追加新的变性的DrivercDNA酶切产物，进行第二次消减杂交，进一步富集差异表达cDNA片段，再利用第一次和第二次特异引物PCR提高产物特异性，并使差异表达cDNA大量富集，最后进行克隆转化，建立文库。差减cDNA文库的构建•从ssH的PcR扩增后的正向差减cDNA群体中取出3ul与载体连接，4℃过夜。从连接体系中取2ul转化受体菌于的琼脂平板上挑取白色菌落(重组子)，点种于盛有液体LB培养基的96孔板中；37℃培养夜后一70°c保种。差示筛选差减DNA文库Northern杂交分析•取抽提的H和M总RNA甲醛凝胶电泳、转膜。•(1)挑取与4种探针杂交信号强度相近的克隆经PcR扩增后用放射性同位素标记探针，与M和H总RNA进Northern杂交，以确证M和H总RNA电泳上样量是否相同。•(2)随机挑取8个复筛的DNA重组r。通过PcR扩增外源插入片段，同收插入片段并标记，分别做Northern杂交cDNA片段的测序和DNA序列分析阳性重组克隆采用自动测序法测序。用BLAsrl软件搜索Gcn—Bank中同源序列进行比较。2、基因克隆1图位克隆技术2转座子或TDNA标签3同源序列法4表达序列标签法5差异表达基因的分离方法基因克隆万方文库3.基因的转化和功能预测基因转化万方文库原理简介：•运用已克隆的目的基因构建植物超表达载体，将目的基因插入带有启动子和终止子的表达载体中，酶切鉴定表明，目的基因已正确地插入载体中。用根癌农杆菌介导法将其转入烟草中，共获得带有目的基因的烟草幼苗。对其植株进行PCR检测，全都扩增出目的条带；进一步对这些株进行Southern杂交检测和RT—PCR检测，发现株系均有杂交带出现且均发生了基因转录，说明已成功获得能够表达•与水曲柳复壮有关的目的基因的转基因烟草。方法•1RNA及DNA的提取•2克隆载体的构建•3表达载体构建•4本生烟草转基因植株的获取•5再生植株检测•结束