水稻内生细菌群落的生物多样性研究-yzxzcom

问题：1、根系改为根系2、将根系细菌鉴定相似指数0.5的排出在分析之外。3、最重要的问题是如何保证细菌鉴定的准确性。4、水稻根系细菌和内生细菌与水稻生物学特性间的相关系数原始数据要列出，表1放到后面。5、根系细菌和内生细菌在不同品种水稻的分布特性要分别分析6、作根系和内生的关系。7、内生菌和根系细菌与生物学特性的关系，8、过来讨论，水稻根系及内生细菌群落结构多样性研究胡桂萍1,2刘波1*郑雪芳1林营志1史怀1尤民生2*(1福建省农林大学应用生态研究所，福建省福州市，350002；2福建省农业科学院农业生物资源研究所，福建省福州市，350003)摘要：为探讨水稻根系细菌和内生细菌群落结构多样性及与水稻的关系。2008年7月从5个品种水稻根系土和茎部分离根系细菌和内生细菌，并进行脂肪酸鉴定。结果表明，分离得到的根系细菌有13个种，隶属于10属，内生细菌有13个种，隶属于9个属，两群落的优势菌均为蜡状芽孢杆菌（Bacilluscereus）。以各菌株在根系土和茎部出现与否为指标，用类平均法对数据进行0-1聚类分析，，根系细菌可以分为3大类群，内生细菌可以分为4大类。对根系细菌、内生细菌和水稻生物学特征参数进行相关分析得到，根系细菌和内生细菌与水稻与千粒重，穗粒数，亩产存在正相关，但与有效穗呈负相关。关键词：水稻，根系细菌，内生细菌，群落多样性StudyonthediversityoftherhizospherebacteriaandendophyticbacteriaofriceGuipingHu1,2,BoLiu1*,XuefangZheng1,YingzhiLin1,HuaiShi1,MinshengYou2*(1InstituteofAppliedEcology,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China;2AgriculturalBiologicalResourceResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou350003,China)Abstract：Theresearchaimedtostudytherelationshipbetweenthediversityofrhizospherebacteriaandendophyticbacteriaandrice.Weisolatedandculturedrhizospherebacteriaandrhizospherebacteriafromtherhizosphereandstemofrice.fatty-acididentificationshowedthatrhizospherebacteriawereclusteredinto10generawhichobtained13speciesandrhizospherebacteriawereclusteredinto9generawhichobtained13species,ThedominantbacteriaisBacilluscereus.Theclusteranalysisresultsshowedthattherhizospherebacteriacouldbeseparatedinto4groups,whereastheendophyticbacteriacanbeseparatedinto3groups.ThecorrelationanalysisindicatedtherelationshipbetweenbacteriaandSeedsettingpercentage、1000-grainweightandplantproductionwerepositivelycorrelatedWhereastherelationshipbetweenbacteriaandeffectivespikeswasnegativelycorrelated.Keywords：rice,Rhizospherebacteria,Endophyticbacteria,Diversityofcommunity植物内生细菌（Endophyticbacteria）是指能够定殖在植物的各种组织和器官的细胞间隙或细胞内，并与植物建立了和谐联合关系的一类微生物(KleopperJWetal,1992)。植物内生细菌具有丰富的生物多样性。大量的研究表明，不但不同植物种类之间内生细菌的类群存在一定的差异，而且同一植物的不同器官、不同生育期、不同生长地区和环境以及不同品种之间也存在明显差异。内生细菌长期生活在宿主体内的特殊环境中，并与宿主协同进化，在演化过程中形成了共生的关系，一方面内生细菌可以从宿主吸收营养供自己生长的需要，另一方面内生细菌在宿主的生长发育和系统演化过程中起重要的作用。感染内生细菌的宿主往往具有生长速度快(何红等，2002)、增加产量（高增贵等，2004；徐进等，2004），抗逆境（张颖等，2007）、抗病害（傅正擎等,1999）等优势。植物根系是一个复杂的生态系统，在这一系统中栖息着各种各样的微生物，其中，细菌是这些微生物中的组要组成成员（赵之伟等，1992），细菌的组成及其生命活动对于植物的生长，产量以及整个生态系统的物质转化和能量流动均有着重要的作用（WatanabeIandRogorPA,1984）。研究表明大量的根系有益微生物具有固氮、解磷、产生植物激素等促进植物生长和防治病害的能力，对植物的益处主要表现在，提高根、茎、叶、穗等氮的含量，增加分蘖数、根长、根面积；提前孕穗期及开花期；增加穗粒数及粒重；提高叶绿素含量及种子萌发率等，提高作物产量等作用。水稻是世界上最重要的谷类作物之一，是世界上50%以上的人口的粮食之源。目前，水稻的产量的提高主要依靠化肥和农药的大面积的施用，虽取得一定的效果，但是也产生了极大的环境问题，所以寻找另外一种新的环保的增产途径尤为重要，而内生菌和根系微生物及其分泌物具有促进生长、提高作物产量的能力，为水稻增产工作也提供新的思路。目前国内外主要是集中于某个植物内生细菌或根系细菌对作物固氮、抗病、促生等作用的研究，而对植物根系细菌和内生细菌相关性研究及两者与植物相互作用的研究甚少。本研究通过分离不同品种水稻根系细菌和内生细菌，了解它们的群落结构组成，并拟通过气象色谱技术快速、准确检测根系细菌和内生细菌的磷脂脂肪酸，利用全自动微生物鉴定系统进行鉴定，从而明确水稻植株内生细菌和根系细菌群落的组成，菌群密度，内生细菌和根系细菌之间的相互关系及其在水稻生长发育过程中所起的作用，为内生细菌和根系细菌资源的进一步研究和开发利用奠定理论基础，于进一步研究它们的作用机制，更加有效利用内生菌和根系微生物资源有重要的作用，也为水稻增产工作开辟新的思路和途径。1材料与方法1.1试验材料水稻由福建省农业科学院稻麦研究所提供，水稻品种为：航1号，航2号，Ⅱ优航1号，Ⅱ优航2号，汕优63，品种生物学特性见表1，随机采样，每个品种采3株，连根带土掘出，将掘出的植株根系土壤部分严密的用塑料袋包裹，带回实验室。表1水稻品种生物学特性Table1biologicalcharateristicsforricevarieties品种Variety全生育期（天）穗瘟(﹪)最高分蘖数（个）有效穗（粒）成穗率（%）穗粒数(个)结实率（%）千粒重（g）亩产(kg)株高(cm)航1号133.6731.1612.138.9173.44122.2978.5228.11485.44117.67航2号133.677.6614.409.3064.49126.6376.8128.23519.93116.67Ⅱ优航1号130.6784.2614.038.3059.51127.5583.2829.22564.80114.00Ⅱ优航2号130.6714.2112.278.4068.34139.5483.8929.17563.54115.67汕优63128.6730.3213.709.2867.99112.5779.1828.43495.06100.001.2试验方法1.2.1根系细菌的分离抖掉与根系松散结合的土体，然后将与根系紧密结合土壤用刷子刷下来作为根系土壤。称取10g土样稀释在90ml无菌水中，震荡，稀释为10-2，10-3，10-4，各取200μL稀释液涂布于NA平板上，处理后的NA平板倒置于30℃暗培养箱培养2天，并计数、纯化、保存分离得到的菌株。1.2.2内生细菌的分离取水稻茎部（距根部10cm-15cm）1g，先用75％酒精浸泡数秒，无菌水冲洗数次后，再用10％次氯酸钠浸泡5min，无菌水冲洗数次后用无菌滤纸吸干表面水分，然后用无菌剪刀剪碎样品在无菌研钵中，充分研磨匀浆，稀释在9ml无菌水中。取200μL稀释液涂布于NA平板上，处理后的NA平板倒置于30℃暗培养箱培养2天，并计数、纯化、保存分离得到的菌株。1.3.3细菌脂肪酸鉴定1.3.3.1细菌脂肪酸的提取①细菌培养条件：TSBA平板培养基，四线划线法，培养温度28±1℃，培养时间24±2h。②获菌：用接种环挑取3～5环（约40mg湿重）的菌落置入一个干净、干燥的有螺旋盖的试管中（最佳的获菌区域为第3区）。③皂化：加入1.0±0.1mL皂化试剂，拧紧盖子，振荡5～10s，放入95～100℃的沸水中5min，室温冷却，振荡5～10s，再水浴25min，室温冷却。④甲基化：开盖加入2.0±0.1mL甲基化试剂，拧紧盖子，振荡5～10s，80±1℃水浴10min，移开且快速用流动自来水冷却至室温。⑤萃取：加入1.25±0.1mL的萃取试剂，拧紧盖子，温和混合旋转10min，打开管盖，利用干净的移液管取出每个样本的下层水相部份。⑥基本洗涤：加入3.0±0.2mL洗涤试剂，拧紧盖子，温和混合旋转5min，打开管盖，利用干净的移液管移出约2/3体积的上层有机相到干净的气相色谱检体小瓶，用于气相检测。1.3.3.2细菌脂肪酸的气相色谱检测在下述色谱条件下平行分析脂肪酸甲酯混合物标样和待检样本：二阶程序升高柱温，170℃起始，5℃·min-1升至260℃，而后40℃·min-1升温至310℃，维持90s；汽化室温度250℃、检测器温度300℃；载气为氢气（2mL·min-1）、尾吹气为氮气（30mL·min-1）；柱前压10.0psi（1psi=6.895kPa）；进样量lμL，进样分流比100:1。1.3.3.3细菌脂肪酸鉴定系统根据各组分保留时间计算等链长（ECL）值确定目标组分的存在、采用峰面积归一化法计算各组分的相对含量，再将二者与系统谱库中的标准菌株数值匹配计算相似度（SimilarityIndex，SI），从而给出一种或几种可能的菌种鉴定结果。一般以最高SI的菌种名称作为鉴定结果，但当其报告的几个菌种的SI比较接近时，则根据色谱图特征及菌落生长特性进行综合判断。以脂肪酸混合标样校正保留时间。细菌鉴定仪对细菌的鉴定判别依赖于相似性指数（SI）：相似性指数大于0.500时，说明匹配性很高，为典型的菌种；大于0.300小于0.500时，说明匹配性较低，为非典型菌种；小于0.300时，说明数据库没有此菌种的数据，给出的是最接近的相关菌种。1.4数据处理根系细菌和内生细菌数量分析采用单因子方差分析（Fisher’sLSDtest）；聚类分析则以分离到的内生菌菌株为样本，以各菌株在各部位出现与否为指标，组成“0-1”数据矩阵，将所得数据输入DPS数据处理系统，采用欧氏距离为聚类尺度，以类平均法对数据进行系统聚类分析；根系细菌和内生细菌与水稻生物学参数先做用单因子方差分析（Fisher’sLSDtest），然后两组数据做相关分析（Pearson2-tailedtest），所用软件为SPSS12.0（SPSSInc.,Chicago,Illinois,USA）。2结果与分析2.1不同品种水稻根系细菌和内生细菌总量试验结果见表2，总体上看，不同品种根系细菌