抗体制备过程

抗体制备过程SP2/0骨髓瘤细胞的复苏和培养骨髓瘤细胞一般保存在-195℃液氮罐中，实验时复苏、增殖、传代即可。由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态，易脱落，因此不需要胰酶处理。但为了防止出现返祖现象，在细胞融合前骨髓瘤细胞株可在15ug/ml8-氮鸟嘌呤的培养基内做适当培养。融合前7—10天对骨髓瘤细胞进行复苏,步骤如下：从-80°C超低温冰箱中取出冻存的SP2/0骨髓瘤细胞，立即放入38°C水浴，并轻轻摇动使其在1min内融化，1000rpm/min，离心10min，弃去上清，缓慢加入1ml10%胎牛血清IMDM完全培养液并轻吸混匀，转入细胞培养瓶补加培养液至4ml，置于37°C，5%CO2培养箱中继续培养。两天后观察细胞的生长情况,更换培养基。一般每两天进行一次传代扩大培养,使细胞处于对数生长期。融合前1天，进行细胞换液并使细胞保持在对数生长阶段。融合当天，将骨髓瘤细胞收集于50ml离心管内，1200rpm，5min，弃去上清；加入20ml基础培养液，轻击管底使细胞团分散，1200rpm，5min，弃去上清；将细胞重悬浮于10ml10%胎牛血清IMDM基础培养基中。取100ul悬液，稀释10倍后加等体积0.4%台盼蓝染液进行活细胞计数，细胞活力应大于95%。计数后,重悬后备用。阴性血清及饲养细胞的制备在体外的细胞培养中，细胞的生长依赖于适当的细胞浓度，单个的或数量很少的细胞不易生存或繁殖，必须加入其他活细胞才能促使其生长繁殖，加入的活细胞称为饲养细胞（feedercell）。饲养细胞能够提高待克隆细胞的密度，使其容易生存与繁殖，还能释放诸如非种属特异性细胞生长因子类的密度，使其容易生长与繁殖[1]。目前常用的饲养细胞为小鼠腹腔巨噬细胞。（1）材料①Balb/c小鼠②10%FBS-IMDM培养液：IMDM基础培养基+10%胎牛血清+1%双抗IMDM培养液445ml、胎牛血清50ml、双抗5ml。③HAT选择培养液：IMDM基础培养液+2%HAT浓缩液(50×)+20%胎牛血清+1%双抗。IMDM基础培养液385ml、2%HAT浓缩液(50×)10ml、20%胎牛血清100ml+1%双抗5ml，过滤除菌，分装保存。④96孔培养板、手术剪、注射器、吸管、血细胞计数板、离心管（2）操作方法①细胞融合前一天，将未免疫的Balb/c小鼠摘眼球取血，作为抗体检测时的阴性对照。②拉颈处死小鼠，浸泡于75%的酒精中消毒5min-10min，移至无菌操作台中。③用眼科手术剪剪开Balb/c小鼠腹部一小口，揭开皮肤，暴露腹腔。④用注射器吸入5ml基础培养液注入腹腔，反复轻揉小鼠腹部3-5min，然后用该注射器回抽腹腔液体，移入50ml离心管。⑤室温1200r/min，离心8min。⑥弃上清液，轻击管底弹松离心管底部细胞，并用HAT培养液重悬细胞，用血细胞计数板计数活细胞，使每毫升约含5.0x105个活细胞。⑦以1ml吸管将细胞转入96孔细胞培养板中，每孔100ul（约含5.0x104个细胞），加到96孔细胞培养板中，置于37°C，5%CO2培养箱中培养。致敏脾细胞（阳性脾细胞）的制备（1）材料①免疫过的血清抗体效价高的Balb/c小鼠。②IMDM培养液③10%FBS-IMDM培养液：IMDM基础培养基+10%胎牛血清+1%双抗IMDM培养液445ml、胎牛血清50ml、双抗5ml。④解剖台板、无菌手术剪、弯头镊子、注射器、离心管、血细胞计数板、倒置显微镜（2）操作方法①取已经免疫过的Balb/c小鼠，摘眼放血，并分离收集血清作为抗体检测时的阳性对照。②颈脱位致死小鼠。浸泡于70%酒精中5-10min，移入超净台中，固定于无菌解剖板上,掀开左侧腹部皮肤,用无菌手术剪剪开腹膜,无菌条件下取出脾脏置于已盛有10ml不完全培养基的平皿中,轻轻洗涤,除去脂肪及结缔组织。③将脾脏移入另一盛有10ml不完全培养棊的平皿中,用Iml注射器在脾脏上扎小孔,再吸上培养基冲洗脾脏,使免疫脾细胞进入平皿中的不完全培养基。反复操作数次。做成脾细胞悬液，用吸管将悬液移入10ml离心管中。④直立10ml离心管10min，沉降大块的结缔组织，把细胞悬液转移到50ml离心管中。⑤以10%FBS-IMDM培养液充满50ml离心管，并在室温1000r/min离心10min，与此同时制备骨髓瘤细胞。⑥用约10ml的新鲜10%FBS-IMDM培养液在悬浮沉淀。⑦重复⑤、⑥⑧计算活细胞。取出100ul悬液，稀释10倍后用0.4%台盼蓝染色计数活细胞，一般细胞数量应达到108为宜。使用血细胞计数板、台盼蓝蓝色、倒置显微镜检测，活细胞数高于80%为合格。细胞融合，选择杂交瘤（1）材料①对数生长期的脾细胞、骨髓瘤细胞、饲养细胞。②IMDM培养液③10%FBS-IMDM培养液：IMDM基础培养基+10%胎牛血清+1%双抗IMDM培养液445ml、胎牛血清50ml、双抗5ml。④HAT选择培养液HAT(50X)10ml、10%FBS-IMDM培养液490ml，过滤除菌，分装保存。⑤HT选择培养液HAT(100X)5ml、10%FBS-IMDM培养液495ml，过滤除菌，分装保存。⑥50%聚乙二醇：取相对分子量为4000、高纯度的聚乙二醇10g放入25ml瓶中高压灭菌，等量（W/V）混合IMDM培养液（40℃预热），以酚红检查PH。⑦10ml、50ml灭菌离心管、24孔细胞培养板、血细胞计数板、倒置显微镜（2）操作方法①在50ml离心管中混合脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞，然后加入50ml10%FBS-IMDM培养液。室温500g离心5min沉淀细胞。②弃上清液，轻敲离心管底部，晃动沉淀，至离心管于水域中，使其达到40℃。③加50%聚乙二醇（40℃预热）0.8ml，用1ml吸管缓慢滴加，边滴加边摇晃离心管，此时肉眼观察可见有颗粒出现，滴加过程要求持续2min。④加1mlIMDM培养液，边滴加边摇动，持续1min（此步骤重复1次）。⑤加1ml10%FBS-IMDM培养液，边滴加边摇动，持续0.5min（此步骤重复1次）⑥加IMDM培养液15ml，室温500g离心3min沉淀细胞。⑦弃上清液，轻敲离心管底部，加25mlHAT培养液。⑧低价融合的细胞液到24孔细胞培养板中（每孔约含1.0X105个饲养细胞），每孔一滴（月0.05ml）。随后放入5%CO2饱和湿度为37℃培养箱中培育。⑨低3、6、9、12日更换HAT培养液（注意轻轻吸去上清液，切勿吸出固定于孔底的细胞，根据需要加入适量的饲养细胞）。⑩第14、16日加入HT培养液。在每次换液前用倒置显微镜观察细胞的生长状况，在10天左右就可观察到大而明亮、立体感强的杂交瘤细胞生长出来，而且每细胞群落数量明显。杂交瘤细胞出现后，吸取上清液，间接ELISA法检查抗体，同时尽早液氮冻存备份和克隆化。（3）注意事项①加入聚乙二醇的过程中，细胞悬浮技术的差错往往导致细胞融合失败。②细胞污染是造成融合试验失败的最主要原因，因此提供一个洁净的环境是细胞融合成功的关键。③更换培养液不超过1/2换液量。④尽量减少从CO2培养箱中取出细胞培养板或培养瓶的次数，不宜经常更换培养液。⑤对阳性孔的及时判断是一项不可忽视的步骤，待细胞群落生长布满96孔板孔1/3左右，24孔板孔1/5左右，就要及时检测各上清液中是否含有特异性抗体，如果发现抗体阳性孔，就应及时克隆化和冻存，以免被其他细胞生长所抑制。⑥用于融合的小鼠骨髓瘤细胞和脾细胞，由于其中一方突变或在种属关系上较远，同样会影响细胞融合。⑦小牛血清的质量、培养液内含有毒成分、HAT、HT失效、聚乙二醇浓度差错或毒性太大等均可造成细胞融合失败。HAT选择杂交瘤细胞：再用HAT选择培养1-2天内，将有大量的骨髓瘤细胞死亡，3-4天后骨髓瘤细胞消失，杂交瘤形成小集落，HAT选择培养液维持7-10天后应换用HT培养液，最后改用普通培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/5面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每2-3天更换一半培养液。抗体的检测细胞融合2周左右即可筛选杂交瘤，及抗体的检测。利用间接ELISA法检测抗体的阳性。杂交瘤细胞的克隆化为了得到完全同质的单克隆抗体，必须对杂交瘤细胞进行克隆化。通常在得到针对预定抗原的杂交瘤以后需连续进行2-3次克隆化。克隆化是指是单个细胞通过无性繁殖获得该细胞群体的整个培养过程。克隆化的方法很多，主要有有限稀释法、软琼脂法、单细胞显微操作法和荧光激活细胞分类法。有限稀释法：细胞融合所选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株，所以只有成功融合的脾细胞和骨髓瘤细胞才能维持存活1周以上。融合细胞克隆生长后，经有限稀释至每孔0.5个细胞，尔后培养细胞覆盖1/5孔底时，用ELISA检测培养上清液抗体含量。（1）材料①活力强的杂交瘤细胞、小鼠腹腔细胞（饲养细胞）②HT培养液：HAT(100X)5ml、10%FBS-IMDM培养液495ml，过滤除菌，分装保存。③96孔细胞培养板（2）操作方法①在96孔细胞培养板孔中依次加入0.1ml腹腔细胞培养液（含1.0X105个腹腔细胞）②制备待克隆的杂交瘤细胞悬液：用含HT的完全培养基进行系列倍比稀释直至每毫升含10个细胞，每孔接种0.1ml细胞悬液，即每孔含1个细胞。③5%CO2饱和湿度为37℃培养箱中培育7-10天，出现肉眼可见的克隆或者在倒置显微镜下能够观察到杂交瘤细胞布满孔底1/5面积时就可检测抗体，随后标出只有单个克隆生长的孔，取上清液做抗体检测。④取检测抗体呈阳性孔的细胞扩大培养、冻存。（3）注意事项抗体阳性克隆有时需要反复克隆化几次。早期杂交瘤细胞不能耐受机械刺激或过度稀释，在转种过程中吹打动作粗暴或细胞液盲目稀释，就容易发生转种后死亡。生长状态欠佳，活性低迷的杂交瘤细胞可直接通过注射到小鼠腹腔，在其体内培养，这样可使杂交瘤细胞恢复活力，而且可以清除支原体。杂交瘤细胞的冻存筛选出的阳性细胞株应及早冻存进行保种。普遍使用的冻存保护剂为二甲亚砜，其相对分子质量小，溶解度大，易穿透细胞膜，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。使用浓度范围在5%-15%之间，常用浓度为10%。二甲亚砜无需灭菌处理，因为二甲亚砜本身对细菌有毒性作用，可自身灭菌。冻存温度越低越好，目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的慢速冷冻法冻存细胞。慢速冷冻法可使细胞内的水分都渗出细胞外，减少胞内形成冰晶的机会，从而减少并冰晶对细胞的损伤。细胞冻存的常用有效方法是细胞在加血清和二甲亚砜的培养基中以一定的缓慢速度下降温度。-20～4℃，每分钟下降0.5℃：-80～-20℃，每分钟下降1℃；到-80℃时则可迅速置于液氮中，可在-196℃液氮中长期保存。冻存一年之后，应再复苏培养一次，然后再继续冻存。一般冻存细胞复苏后的活性多在50%～95%之间。如果低于50%，则说明冻存、复苏过程中有问题。（1）材料①处于对数生长期、活力好的杂交瘤细胞②10%FBS-IMDM培养液：IMDM基础培养基+10%胎牛血清+1%双抗IMDM培养液445ml、胎牛血清50ml、双抗5ml。③10%二甲亚砜保护液：含二甲基亚砜50ml，胎牛血清200ml、IMDM培养液250ml④灭菌冷冻管、纱布袋、线绳、-80℃冰箱、液氮及液氮罐（2）操作方法①选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好更换新鲜的10%FBS-IMDM培养液。②除去细胞培养液中的培养液，加入新鲜的10%FBS-IMDM培养液。用吸管吸取培养液，反复轻轻吹打贴附在瓶壁上的细胞，使细胞均匀分散悬浮。③1000r/min离心10min，弃上清液。细胞沉淀用10%二甲基亚砜保护液制成悬液，使成1.0X107细胞/ml。④取样，台盼蓝染色，计数活细胞，存活率应在95%以上。⑤分装冻存管，冷冻管要将盖子盖紧，每瓶1ml，在酒精灯上封口冷冻管。⑥置4℃冰箱1小时；置-20℃冰箱1h；置-80℃冰箱15h。⑦从-80℃冰箱取出冷冻管，将有布袋包裹的冷冻管移入液氮罐气态部分暂放2h，最