抗体库技术.

5抗体库技术•通过DNA重组技术克隆全套抗体可变区基因,并在原核系统表达有功能的抗体分子片段,这种全套抗体基因表达文库称为抗体库---沈倍奋:重组抗体在蛋白质组学研究中的应用-细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmunol)2003,19(2):105-106•抗体库技术的主导思想，是将某种动物的所有抗体可变区基因克隆在质粒或噬菌体中表达利用不同的抗原筛选出携带特异抗体基因的克隆，从而获得相应的特异性抗体•基因工程抗体技术，是继杂交瘤单克隆抗体技术以后抗体领域的又一次革命•噬菌体抗体库技术又被誉为这次革命中的革命•该技术的最大优势在于可以使人们绕过杂交瘤和免疫而建立天然全套噬菌体抗体展示文库，从库中容易地筛选出任一感兴趣的抗体抗体库技术包括的主要过程：•克隆出抗体全套可变区基因•与有关载体连接•导入受体菌系统•利用受体菌蛋白合成分泌等条件，将这些基因表达在细菌、噬菌体等表面•进行筛选与扩增，建立抗体库本章内容•5.1初期的抗体库•5.2噬菌体抗体库技术•5.3大容量抗体库•5.4抗体库技术的应用•5.1.1背景•5.1.2初期的抗体库5.1初期的抗体库•DNA重组技术的发展和抗体基因结构的阐明，促进了80年代初基因工程抗体的发展•基因工程抗体，极大地改善了抗体的性能和扩展了抗体的应用范围5.1.1背景•抗体库技术，通过DNA重组技术，克隆全套抗体可变区基因，在原核系统表达有功能的抗体分子片段（即抗体库），从中筛选特异性抗体的基因。•两项关键技术：•PCR：用一组引物，扩增出全套免疫球蛋白的可变区基因•以大肠杆菌(或噬菌体)直接表达有功能活性的抗体分子片段•噬菌体展示技术（phagedisplay）应用到抗体的表达与克隆5.1.2初期的抗体库•Ward等:大肠杆菌表达出VH段21/2，000个克隆与溶酶体特异性结合的克隆PCR扩增出VH基因脾细胞DNA溶菌酶免疫小鼠1989年Huse等，在Science上发表了完整的抗体库工作：•用逆转录-PCR技术从淋巴细胞克隆出抗体轻链基因库（repertoire）和重链Fd段基因库•Repertoire所有的节目•将轻链和重链基因分别组建到噬菌体表达载体中，得到轻链基因库和重链Fd段基因库•通过DNA重组技术将轻链基因和Fd段基因随机配对重组于一个表达载体中，形成组合抗体（基因）库•P109•感染大肠杆菌，噬菌体形成噬菌斑•相应噬菌体载体上的κ链基因和Fd段基因得到表达，形成有功能的Fab段，释放于噬菌斑内•将噬菌斑转印到硝酸纤维素膜上•用标记的抗原筛选产生特异性抗体的克隆，得到其Fab段的基因，•建立了完整的抗体库技术较细胞融合杂交瘤技术的优越性：•1.省去了细胞融合的步骤•2.扩大了容量，106以上个克隆•3.直接得到抗体的基因，不丢失，便于进一步构建抗体•4.利用原核表达系统的优势•5.可制备难于制备的抗体5.2噬菌体抗体库技术•噬菌体展示技术（phagedisplaytechnology）的应用5.2.1噬菌体展示技术•将肽段的基因克隆到丝状噬菌体的基因组DNA中•与噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白•呈现于噬菌体表面特点：将特定分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内5.2.1.1丝状噬菌体•M13•fd•f1•复制型DNA被用来做基因克隆的载体•基因组为单链环状DNA•基因中有一段基因间隔区（intragenicregion）,含有病毒合成的起始和终止信号，以及子代噬菌体生成组装的信号•基因组共编码10种蛋白质，包括结构蛋白和DNA合成和子代噬菌体的包装释放所需蛋白•管状蛋白外壳，蛋白Ⅷ（2700-3000个），蛋白质Ⅲ和Ⅵ，蛋白质Ⅶ和Ⅸ噬菌体对大肠杆菌的感染：•1.通过蛋白质Ⅲ对细菌表面性菌毛的识别感染细菌•2.感染后其基因组DNA进入细菌•3.DNA转变为双链DNA•4.在噬菌体蛋白的作用下，复制大量单链DNA•5.与细胞膜上的噬菌体外壳蛋白组装成完整噬菌体。用于噬菌体展示的基因Ⅷ和Ⅲ蛋白•蛋白Ⅷ：50个氨基酸，中央一段疏水，可先镶嵌在细菌内膜上；可多价表达。•当外源蛋白的基因与基因Ⅷ融合，就会在噬菌体表面表达•蛋白Ⅲ：406个氨基酸，在感染的细菌内，羧基端固定在内膜上，氨基端朝向质周腔每个噬菌体有3-5个副本，氨基端与大肠杆菌的性毛结合，介导感染；羧基端与子代噬菌体的释放有关可低价表达外源蛋白，有利于高亲和性配体的筛选5.2.1.2噬菌体展示技术的选择功能•筛选过程：Propagation增殖•优越性：简便易行筛选能力强可直接得到特异克隆编码DNA5.2.2噬菌体抗体库•将多样性可变基因组装到表达载体内，表达到噬菌体表面得到多样性噬菌体抗体的集合，即噬菌体抗体库（phageantibodylibrary）•通过吸附-洗脱-扩增的富集过程，可有效地从噬菌体抗体库中筛选到特异性抗体的可变区基因5.2.2.1噬菌体抗体•1.噬菌体抗体表达的分子片段•表达Fab时，将轻链基因和Fd基因组合在同一个表达载体内，或不同载体导入同一个大肠杆菌细胞内，一个基因与外壳蛋白形成的融合蛋白链固定在细胞内膜上，另一链分泌到质周腔，二者可形成有活性的抗体•表达ScFv时，通过重叠延伸拼接法（replicingoverlapextension,ROE）用PCR直接将轻链和重链可变区基因组合在一起；构建ScFv时用可变区3’端做引物，不受重链同种型的限制，有更好的多样性。•重叠延伸PCR技术(genesplicingbyoverlapextensionPCR,简称SOEPCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来.•此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理•表达dsFV：将可变区与基因Ⅲ融合，可在噬菌体表面表达出dsFv•表达Diabody:与基因Ⅲ融合，可在噬菌体表面表达出双链抗体•2.噬菌体抗体的表达载体•丝状噬菌体载体将抗体基因克隆在基因Ⅲ5’端前导序列的下游，融合蛋白可表达•噬粒为基础载体质粒含有丝状噬菌体基因间隔区在丝状噬菌体蛋白存在时，介导噬菌体DNA的复制、包装和释放，产生子代噬菌体颗粒。•噬粒(phagemid或phasmid)是由质粒载体和单链噬菌体载体构建成的•它们既有质粒的复制起点，又有噬菌体的复制起点•在大肠杆菌细胞里，可以按正常的双链质粒分子进行复制，生成双链DNA•当宿主细胞受到辅助噬菌体感染后，噬粒载体便按单链噬菌体的方式进行复制，然后由辅助噬菌体提供的外壳蛋白包装成噬菌体颗粒•辅助噬菌体是一类自身DNA复制效率极低的突变型，但可为宿主细胞的质粒DNA提供复制和包装所需的蛋白酶和外壳蛋白•用辅助病毒超感染，辅助病毒提供所有的丝状噬菌体蛋白，将噬粒DNA以单链的形式包装在噬菌体外壳蛋白内，形成病毒颗粒，可以感染大肠杆菌，但不产生（辅助噬菌体）子代噬菌体。•噬粒载体中插入抗体分子片段与基因Ⅲ或基因Ⅷ•融合蛋白将嵌在细菌内膜•辅助病毒感染细菌后•融合蛋白与野生型的蛋白Ⅲ或蛋白Ⅷ共同组装到生成的噬菌体表面•3．噬菌体抗体的价•在筛选低亲和力噬菌体抗体时可选用多价的噬菌体抗体•筛选高亲和力噬菌体抗体时应选用单价的噬菌体抗体•蛋白Ⅷ，2700个亚基，多于10肽会影响蛋白Ⅷ功能，不能用噬菌体载体表达蛋白Ⅷ-抗体融合分子•噬粒做表达载体，来源于辅助病毒的野生型蛋白Ⅷ和蛋白Ⅷ-抗体融合蛋白共同组装到噬菌体表面，各自的表达数目取决于两者的相对数量•每一个噬菌体表面可表达24个左右的抗体分子•基因Ⅲ(蛋白Ⅲ)：•用噬菌体载体产生多价抗体分子•用噬粒表达，所产生的噬菌体抗体颗粒中10%表达有抗体分子片段，单价•4膜型和可溶性抗体分子的表达•膜型表达可溶性抗体分子的产生：•①在表达载体中基因Ⅲ或Ⅷ的两端设计两个适当的限制性内切酶位点，以除去外壳蛋白的基因•②在抗体基因和外壳蛋白基因之间设计一个琥珀密码子（TAG）：a在含有琥珀抑制基因的宿主菌中，可翻译为酪氨酸、色氨酸等，表达为抗体-外壳蛋白融合分子b在无抑制基因的宿主菌中则UAG为终止密码子，抗体分子表达为可溶性蛋白5.2.2.2抗体库筛选技术•1.用于筛选的抗原•能够将结合与非结合形式的噬菌体分离开的方法均可用于筛选•a可溶性抗原包被于酶标板（聚苯乙烯）•b将抗原固定化到琼脂糖微珠上，亲和柱层析•C生物素-抗原+抗体库→•↓•生物素-抗原-抗体+磁珠-链亲和素•↓•磁珠-链亲和素-生物素-抗原-抗体•↓磁场•特异性抗体分离•复杂抗原-细胞，可获得与天然状态下膜分子结合的抗体。•体内筛选，抗体从尾静脉注入小鼠体内，2hr后取胸腺，回收结合的噬菌体抗体。•2.回收与筛选策略•（1）结合抗体的回收•酸碱洗脱，最常用•GenenaseⅠ酶切部位的引入•.（2）利用特异性增加回收率•减差法：P114,anti-CD55single-chainFv•抗原遮蔽法:：遮蔽优势抗原，筛选缺乏选择优势的抗体•路标选择法（pathfinderselection）P115•（3）功能性筛选•抗体酶催化噬菌体抗体与固相基质产生共价结合（4）选择型感染（selectivelyinfectivephage,SIP）•利用噬菌体蛋白Ⅲ的结构功能特点，使只有和特定抗原结合的噬菌体抗体能感染细菌得到扩展。•蛋白Ⅲ3各功能区：•氨基端N1：68Aa,与噬菌体传入病毒有关•中间N2：131Aa,涉及与细菌表面菌毛的结合•羧基端CT：149Aa,含有穿膜锚定区，参与病毒颗粒的形成。•只有具备N1和N2的噬菌体才有充分的感染力。•原理：•构建抗体基因-蛋白ⅢCT基因，噬菌体不能感染细菌•抗原-蛋白ⅢN1和N2融合蛋白•选择性感染回收特异性抗体•P1175.3大容量抗体库•5.3.1总抗体库的容量•5.3.2总抗体库的多样性•自学•相关概念：库容亲和力10-7-10-8/mol/L,解离常数5.4抗体库技术的应用•5.4.1制备人源抗体•5.4.1.1从免疫后个体制备人源抗体•5.4.1.2不经免疫制备人源抗体•5.4.2应用抗体库技术改良抗体性能•5.4.2.1改善ScFv接头的性能•5.4.2.2提高抗体的表达量•5.4.2.3改善抗体的特异性•5.4.2.4提高抗体亲和力突变策略高亲和力克隆的选择HOMEWORK•名词解释•抗体库技术：•phageantibodylibrary•phagedisplaytechnology•选择型感染（selectivelyinfectivephage,SIP）•回答问题•1.较细胞融合杂交瘤技术,抗体库技术有何优越性？•2.选择一种方法，从抗体库中筛选出你想要的抗体