拉曼光谱2

§4.2激光拉曼光谱仪4.2.1色散型激光拉曼光谱仪4.2.3共焦拉曼显微拉曼光谱仪4.2.2傅立叶变换拉曼光谱仪色散型拉曼光谱仪光源样品装置单色器信号处理系统4.2.1色散型激光拉曼光谱仪外光路样品池激光器单色器检测和记录系统图：激光拉曼光谱仪示意图一、光源1.激光光源的特性A强度不高，需要长时间照射样品，对光敏性样品不利B汞线较宽，单色性差，无法进行高分辨光谱的测量C汞灯发散角大，不能很好聚焦，方向性差，无法进行微量分析和单晶光谱的测量在激光光源出现之前，使用最广泛的是汞孤灯，汞孤灯的缺点是：激光光源的优点A强度高，能量在空间和时间高度集中，测定时间缩短C方向性好，发散角极小，光束可以聚焦到很小的面积（10-5—10-6cm2），可对极微量样品（0.05μg）和单晶进行测量D偏振性好，便于进行退偏振比的测量，提供物质结构对称性和振动对称性的信息B单色性好，线宽窄，拉曼光谱谱峰尖锐，分辨率好，容易进行高分辨光谱测量2.常用的激光光源He-Ne激光器，氩离子激光器，氪离子激光器,某些固体激光器以及染料激光器。气体激光器在输出激光谱线的同时，还伴有自发辐射产生的等离子线。强度比激光小几个数量级，比拉曼线强1—2个数量级，是杂散光的来源之一，干扰拉曼光源的测量，故需要滤光单色器即前置单色器。He-Ne激光器输出波长为632.8nm，输出功率在100mW以下，使用寿命1500小时氩离子激光器有多谱线输出，功率高，稳定性好，常用的谱线488.0nm和514.5nm，使用寿命1000小时。氪离子激光器输出最强谱线波长为647.1nm。可调染料激光器，可提供波长在一定范围内连续可调的激光，避开激光发出荧光的谱线激发样品避免荧光干扰，另外可选择合理的波长进行共振拉曼光谱测量。激光器振荡波长/nm输出功率/mW氦–氖激光器氦–镉激光器氩离子激光器氪离子激光器二氧化碳激光器XeBr准分子激光器XeCl准分子激光器XeF准分子激光器632.816441.565325.0488.0514.5530.9647.11060028230835150501013001700200500表常见的气体激光器及其振荡波长和输出功率二、样品装置1.样品装置的作用：是使激光聚焦在样品上，从而对样品进行照射及收集拉曼散射上图为一种测液体试样的样品装置图三种方式：90°、180°及0°照射方式。2.样品的照射方式90°照射方式可以提高拉曼散射与入射光和瑞利散射的比值，有利于低频区拉曼线的观测，适用于固体、液体、气体。180°照射方式多用于具有高反射率的样品，使入射光线按原路返回以抑制它对拉曼线的干扰。对高反射率样品，180°照射方式的散射光收集效率比较高，信噪比也比较大0°照射方式是入射光的方向与收集散射光的方向相同，这样激发光就很容易进入单色仪，对拉曼光谱测量造成干扰。关键是抑制激发光的干扰，如采用碘蒸汽盒，对514.5nm光有强烈吸收90°照射方式（1、2—透镜；3—样品；4—夹缝；5、6—反射镜）180°照射方式（1、2—透镜；3—样品；4—夹缝；5、6—反射镜）0°照射方式（1、2—透镜；3—样品池；4—夹缝；5、6—反射镜）样品的照射方式图示3.样品池除了三维可调的平台之外，还有可更换的各式样品池和样品架。常用样品池：(1)毛细管池(2)液体池(3)气体池(4)旋转池，为了防止激光长期照射引起样品的局部过热或光分解，采用旋转技术(5)单晶平台架(6)压片样品架此外，还有低温池，高温池和高压池固体旋转样品池差分样品池液体旋转样品池高温样品池低温样品池三、单色器1.单色器的作用：对散射光进行分光。2.单色器要求：单色器成像质量好，分辨率高，杂散光小。常用的双单色器有：Littrow型Eber-Fastie型Czemy-Tuyner型一般采用光栅分光。一个光栅不够理想，常采用双单色器。四、检测与信号处理系统1.单道探测：采用光电倍增管作检测器，通过单色器光栅扫描，不同波长的光相继进入探测器。用光电倍增管检测所得到的是时间分布光谱。（1）直流放大，用于较强信号，检测灵敏度较低（2）交流放大，探测灵敏度比直流放大高2—3个数量级。放大接受器输出信号的方法：（3）光子计数。优点：把暗电流信号的大部分与光脉冲区别开来，灵敏度增加。缺点：最大信号受到最大光子计算率的限制。直流放大和光子计数同时使用。2.多道探测单道探测是时间分布光谱，记谱速度慢。人们研制出一系列多道检测器：像硅靶摄像管，二极管阵列，CCD电荷耦合器件。得到的是空间分布光谱，提高了记谱速度。3.CCD检测装置A.CCD简介CCD检测器是一种结合数字信号处理技术构成的多道光信号检测装置。它是基于金属－氧化物－半导体(MOS)技术的光敏元件,其检测原理为聚集在势阱中的光生电荷量与入射光强度和积分时间有着线性的关系。它有两种基本类型:一种是电荷包存贮在半导体与绝缘体之间的界面,并沿界面传输(表面沟道CCD);另一种是电荷包存贮在离半导体表面一定深度的体内,并在半导体体内沿一定方向传输(体沟道或埋沟道CCD)B.基本原理CCD的基本功能是电荷的存贮和电荷的转移,因此,CCD的基本工作原理是信号电荷的产生、存贮、传输和检测。C.CCD检测装置的特点具有光谱范围宽，量子效率高，转换线性好，分辨率高等优点。高灵敏度的CCD有助于提高拉曼光谱信号的检测能力,从而可以减少分析时间以及可以使用低功耗、低成本激光器。据此不仅避免了样品的光分解,还提高了分析的精密度。另外,由于CCD在近红外区有宽的光谱响应,可选择波长较长激发激光以减少来自于复杂样品的发光背景的影响。4.2.2傅立叶变换拉曼光谱仪色散型拉曼光谱仪大都采用可见光作激发光源和透散光栅分光得到拉曼光谱。这类光谱仪存在的缺点：（1）采用可见光激发，容易产生荧光。在生物大分子分析时最严重的问题是往往将拉曼光谱掩盖，造成高背景。而采用时间分辨拉曼光谱,紫外激发共振拉曼光谱，表面增强拉曼光谱以及一些非线性检测光谱如CARS等来克服荧光干扰。（2）可见光能量高，样品易光解，热解。（3）使用光栅分光和狭缝，光谱分辨率受到限制，光谱波数的重现性和精度差。用标准样品校正波数，狭缝限制了光通量，信噪比不高。（4）逐点扫描，测量时间较长。早期傅立叶变换拉曼光谱仪存在主要的问题（A）迈克尔逊干涉仪对杂散光的扫描能力远低于分光扫描系统中的双光栅单色仪。（B）从拉曼光强公式：I=K(ν)A(ν)ν4I0J(ν)CI表示拉曼谱线强度，K(ν)表示整个仪器的响应函数，A(ν)是介质的自吸收，ν是频率，I0是入射光的强度。J(ν)是克分子散射参数，c是散射物的浓度。我们知道用1064nm波长的近红外激光激发拉曼散射光强比用514.5nm可见激光激发要弱1/16。（C）当时的红外探测器的灵敏度比用于可见光波段测定的光电倍增管低1－2个数量级。傅立叶变换拉曼光谱仪与色散型拉曼光谱仪完全不同，它主要由以下几个部分组成：激光光源，样品室，相干滤波器，Michelson干涉仪，检测器，计算机处理数据（进行傅立叶变换）。傅立叶变换拉曼光谱仪组成A.A.Michelson（1852—1931）傅立叶变换拉曼光谱仪的光路图目前在国内常见的几种傅立叶变换拉曼光谱仪有以下几种：1.Nicolet950FT-Raman2.Bio-RadFT-RamanⅡ型3.BrukerRFS-100型1.采用1064nm的Nd:YAG激光代替了通常的可见激光。用以调整和校正仪器的方便。2.采用Michelson干涉仪代替通常的光栅单色器。瑞利散射光的降低采用介质膜棱光镜（也称光学过滤器），它可放在样品光路和干涉仪之间。3.探测器采用对近红外有灵敏效应的Ge二极管和InGaAs探测器。傅立叶变换，获得拉曼位移即拉曼光强。FT-Raman光谱仪与常规激光拉曼光谱仪的不同之处（1）由于采用近红外激光激发，可避免荧光干扰，扩大Raman光谱的应用范围，有很高的信噪比。（2）用近红外光激发，能量低，可避免样品的光解和热解。（3）傅立叶变换拉曼有分辨率高，波数精确和重现性好的优点。测量精度可达到10-3cm-1并且重现性好。（4）FT-Raman光谱仪的测量速度快，一次扫描可完成全波段扫描范围测定。（5）FT-Raman光谱仪可消除瑞利谱线，瑞利线的存在将使弱拉曼谱线变的模糊。Raman光谱仪操作方便，样品的散射信号只需聚焦于8mm的孔，而在可见光Raman光谱仪中散射信号必需聚焦于约100µm宽的狭缝。（6）近红外光在光导纤维中传递性能好，可用于遥感检测。FT-Raman光谱的特点：FT-Raman光谱的缺点（3）水对近红外光有吸收，它影响了FT-Raman光谱仪测量水溶液的灵敏度。可用重水溶解样品，以减少对近红外光的吸收。（1）单次扫描信噪比不高，可通过增加扫描次数来提高信噪比。（2）在低波数区测量方面，FT-Raman光谱仪不如色散型拉曼光谱仪，色散型拉曼光谱仪可达几个波数，而FT-Raman一般只能在250cm-1以上测定，拉曼光谱仪的特点是检测低频振动的能力，FT-IR可达10cm－1，FT-Raman最低可达50cm－1由于拉曼光谱信号强度与入射波长的4次方成反比，故近红外光源抵消了FT-Raman光谱光通量大的优点。致使出现下面缺点:傅立叶变换拉曼光谱的应用FT－Raman能避免荧光干扰，从而大大拓宽Raman光谱的应用范围。图2是聚（对苯撑）对苯二甲酰亚胺的可见光Raman和FT－Raman光谱图。聚（对苯撑）对苯二甲酰亚胺是一种在可见光激发下能产生荧光的物质。它的可见Raman光谱（图2A）有很强的荧光背景，使其特征拉曼峰都被掩盖了，而在其FT－Raman光谱（图2B）中没有荧光背景，信噪比很高。鸡腿骨组织也是一种在可见光激发下能产生荧光的物质。同样，它的可见光Raman光谱（图3A）的荧光背景非常强烈，而其FT－Raman光谱（图3B）则是去荧光的。4.2.3共焦显微拉曼光谱仪左图为英国雷尼绍公司(Renishaw)inVia型号共焦显微拉曼光谱仪进入90年代，拉曼光谱仪的研制获得了重要进展。研制出新一代激光共焦显微拉曼光谱仪。1.主要组成激光器作为单色光源，有可见光和近红外激光器，以及紫外激光器可供选择；能抑制瑞利散射，有高效透过拉曼信号的全息滤光片；二维CCD探测器，能够在可见和近红外区进行有限噪声关闭检测；计算机数据处理系统和探头等。2.共焦拉曼显微拉曼光谱仪基本原理A.激光可经由物镜聚焦成单一的光点来照射样品特定深度的某一点（光斑半径约为1μm）；B.拉曼散射光经由物镜聚焦成单一的光束，完全通过CCD前的狭缝；C.其他在焦点之上及之下的非焦点所产生的背景散射在狭缝周围被阻挡下来。共焦拉曼显微拉曼光谱仪动画演示说明3.共焦显微拉曼光谱仪的应用共焦显微拉曼光谱（CRM）的灵敏度和空间分辨率能让我们得到高质量单细胞和染色体的非共振拉曼光谱图，可以进行生物组织切片的激光拉曼扫描，从而得出样品在不同深度的拉曼光谱。在这方面的应用有：癌症的早期诊断；以及皮肤各层组织的分子浓度分布和药物分子对其渗透作用的体内无损检测。手臂（左）和手掌（右）角质层组织的体内检测结果：左纵坐标为水和蛋白质的信号强度比；右纵坐标为水的质量百分比