杨燊.珠子参根部适合SSR标记的DNA不同提取方法及保存方法的研究

珠子参根部适合SSR标记的DNA不同提取方法及保存方法的研究杨燊1（玉溪师范学院，资源与环境学院，08级生物科学，2008034129，玉溪653100）摘要：目的：探讨适合SSR标记的DNA不同提取方法及保存方法的最佳方法。方法：用经典CATB法,改良CATB法，SDS法，高盐低PH法，提取新鲜珠子参根部中总DNA，并对DNA进行电泳和紫外光检测得出最佳提取方法；选用最佳提取方法提取不同保存方法（新鲜材料、硅胶干燥、自然阴干、太阳暴晒干燥）的总DNA，并对DNA进行电泳和紫外光检测得出最佳保存方法。结论：最佳提取方法为改良CATB法，最佳保存方法为新鲜材料，其次硅胶干燥和阴干的材料也适合SSR标记。关键词：珠子参；DNA提取；SSR分析；CATB法；SDS法；高盐低PH法珠子参(PanacisMajirisRhizama)属于五加科、串珠状根茎植物，别称钮子七、珠儿参、扣子七。分布于我国的四川、陕西、云南等省。具有活络、止血的功效[1-2]。现代药理学研究显示,珠子参具有较广泛的药理作用,对心血管系统、血液及造血系统、免疫系统、肿瘤等均有作用[2]。因此珠子参具有极高的研究价值，所以本实验用珠子参作为材料进行实验。珠子参根部次生代谢产物较多，其中酚类多糖类物质会影响珠子参总DNA的提取及SRR分析。本实验主要为了选取适合SSR分析的DNA不同提取方法及保存方法的最佳方法，以便更加有效地提取珠子参总DNA。1材料与实验方法及操作1.1材料1.1.1实验材料实验材料取自大理市鹤庆县草海镇马厂的珠子参。该实验需要用到不同的提取方法及不同的保存方法，所以将各类方法和保存方法做如下标记：A、经典CTAB法，B、改良CTAB，C、SDS法，D、高盐低PH值法，X、新鲜材料，G、硅胶干燥，Y、自然阴干，S、太阳暴晒干燥。1.1.2仪器离心机，水浴锅，冰箱，电泳仪，移液枪，RCP扩增仪，凝胶成像仪1.1.3试剂CTAB提取缓冲液：(10.00gCTAB，50.0mL1mol/LTris-HCl(pH8.0)，1作者简介；杨燊（1990-），男，汉族，玉溪师范学院在校学生，200803412920.0mL0.5mol/LEDTA，41.00gNaCl，定容至500mL）；3%SDS提取缓冲液：(0.1mol/LTris-HCl（pH8.0），0.05mol/LEDTA-Na2，SDS，定容至250mL)；去多糖Buffer：(100mlTris-HCl(1mol/L)，50mlEDTA(0.5mol/L），NaCl7.305g，定容至500ml)；高盐低PH值提取缓冲液：(0.1mol/L、pH=4.8NaAc,0.05mol/L、pH8.0EDTA-Na2，0.5mol/LNaCl，2%PVP，2%SDS，pH=5.5)；TE：(5ml1mol/LTris-HCl，1ml0.5molEDTA,定容至500ml)；3%琼脂糖凝胶：(0.6g琼脂糖,20ml1%TBE缓冲液)；10X的TBE：（Tris碱108.00g，EDTA7.44g，硼酸55g,定容至1000ml）；40%的聚丙烯酰胺凝胶：（双丙烯酰胺2.00g，丙烯酰胺38.00g，定容至100ml）；6%的聚丙烯酰胺凝胶：（10xTBE12ml，40%聚丙烯酰胺凝胶18ml，90mlH2O）；银染所需试剂：（0.1%AgNO3溶液，3%Na2CO3溶液,10%HAc溶液,1%Na2S2O3溶液）；0.5mol/LEDTA，β-巯基乙醇，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，Tris饱和酚，氯仿/异戊醇(V/V=24:1)，异丙醇，75%乙醇，琼脂糖，无水乙醇，5mol/LKAc，1X的TBE，TEMED，APS，硝酸，二甲苯氰，溴酚蓝1.2实验方法及操作1.2.1经典CATB法[3](有改动)(1)取3份新鲜珠子参每份0.5g分别放入3个研磨中加入1200μl65℃预热的CTAB提取缓冲液混匀；(2)迅速将1.5ml离心管置于65℃水浴中，保温60min,每隔15min温和颠倒混匀；(3)待冷至室温后，取出1.5ml离心管，取上清液于另一离心管，每管加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)溶液，混匀后至溶液呈乳浊状，10000r/min离心10min；(4)小心将上清液相转移至另一个1.5ml离心管中，标号A1，A2，A3，在上清液中加入600μl预冷-20℃的异丙醇，轻轻混匀，至有白色絮状沉淀出现，-20℃静置保存1小时。(5)离心管从冰箱取出后10000r/min离心10min弃上清液，沉淀DNA；(6)用400μl75%的乙醇洗2次，7000r/min离心3min弃上清液；(7)然后再用400μl无水乙醇洗，7000r/min离心3min弃上清液，然后置于空气中干燥；(8)沉淀干燥后溶于加有100μl的TE溶解，待溶解后放入冰箱保存备用。1.2.2改良CATB法[3-4](有改动)(1)取3份新鲜珠子参每份0.5g分别放入3个研磨中加入少许石英砂和PVP，加入1.2ml的Buffer去多糖和24μlβ-巯基乙醇充分研磨成粉末，迅速将研磨好的珠子参粉末装入1.5ml离心管中；(2)10000r/min离心10min弃上清液；(3)向3个1.5ml离心管中加入600μl65℃预热的CTAB提取缓冲液同时加入24μlβ-巯基乙醇，用毛细玻璃管搅拌充分；(4)迅速将1.5ml离心管置于65℃水浴中保温60min，每隔15min温和颠倒混匀；(5)待冷至室温后，取出1.5ml离心管，每管加入240μlKAc，放入冰箱-20℃60min；然后10000r/min离心10min(6)小心将上清液相转移至一干净的1.5ml离心管中，同时加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)溶液，放入垂直振荡器中充分混匀10分钟，然后10000r/min离心10min；(7)取上清液且分别标号B1，B2，B3干净的1.5ml离心管中，然后加入640μl-20冰浴的异丙醇，放入-20℃冰箱冷冻60min；(8)取出后在10000r/min离心10min沉淀DNA，弃上清液用75%的乙醇洗2次，7000r/min离心3min弃上清液；然后再用400μl无水乙醇清洗，洗后7000r/min离心3min，弃上清液，沉淀放置空气中干燥过夜；(9)沉淀干燥后溶于加有100μl的TE溶解，待溶解后放入冰箱保存备用。1.2.3SDS法[5-6](有改动)(1)取3份新鲜珠子参每份0.5g分别放入3个研磨中加入1200μlSDS提取缓冲液，并加入240μlβ-巯基乙醇充分研磨成粉末，迅速将研磨好的珠子参粉末装入1.5ml离心管中；(2)65℃水浴保温60min，每15min轻摇一次；(3)待冷却后加入230μl5mol/LKAc,混合后冰浴60min；(5)取出后10000r/min离心10min，将上清液转移至另一1.5ml离心管中，每管加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)溶液，然后放入垂直振荡器中充分混匀10分钟；(4)取出后10000r/min离心10min；(5)取上清液于分别标号C1，C2，C3干净的1.5ml离心管中，每管加入600μl预冷的异丙醇溶液混匀，放入-20℃冰箱冷冻60min；(6)取出后在10000r/min离心10min沉淀DNA；(7)弃上清液用75%的乙醇洗2次，7000r/min离心3min弃上清液；(8)然后再用400μl无水乙醇清洗，洗后7000r/min离心3min，弃上清液，沉淀放置空气中干燥过夜；(9)沉淀干燥后溶于加有100μl的TE溶解，待溶解后放入冰箱保存备用。1.2.4高盐低PH值法[7-8]（有改动）(1)取3份新鲜珠子参每份0.5g分别放入3个研磨中分别加入1200μl高盐低PH值提取缓冲液，充分研磨成粉末，迅速将研磨好的珠子参粉末装入1.5ml离心管中；(2)65℃水浴保温60min，每15min轻摇一次；(3)取出后10000r/min离心10min，将上清液转移至另一1.5ml离心管中，每管加入600μlKAc溶液，然后混匀，放入-20℃冰箱冷冻60min；(4)取出后10000r/min离心10min；(5)取上清液于分别标号D1，D2，D3干净的1.5ml离心管中，每管加入600μl预冷的异丙醇溶液混匀，放入-20℃冰箱冷冻60min；(6)取出后在10000r/min离心10min沉淀DNA；(7)弃上清液用75%的乙醇洗2次，7000r/min离心3min弃上清液；(8)然后再用400μl无水乙醇清洗，洗后7000r/min离心3min，弃上清液，沉淀放置空气中干燥过夜；(9)沉淀干燥后溶于加有100μl的TE溶解，待溶解后放入冰箱保存备用。1.3PCR扩增[9]（有改动）将4种提取方法所提取的总DNA于NYCTECHNIKINC生产的ATC201PCR扩增仪用SSR分析[10]进行扩增。反应体积25μl，引物：5’-TAGTAGCGACGATCACCACG-3’。PCR扩增反应体系如下（1μlTap酶,1μldNTP(10mM),5μl10Xbuffer(Mg2+20mM),1μlprimerF,1μlprimerR,1μlDNA模板（约50ng）,15μlH2O）。PCR扩增体系如下（94℃5min,(94℃45s,53℃1min,72℃1min30s进行36次循环)，72℃7min,4℃保存）。1.4琼脂糖凝胶电泳用3%的琼脂糖凝胶对4种提取总DNA进行电泳。然后用凝胶成像仪拍照。1.5聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染[11-12]（有改动）先用6%的聚丙烯酰胺凝胶与促凝剂TEMED和APS混合制作胶版，然后用PCR扩增出来的样品与溴酚蓝混合后进行点样，250V电泳150min。取出板后进行银染，过程如下（先用25%的酒精溶液漂洗3min，再水洗1min；1.6%硝酸溶液硝化至二甲苯氰褪色，即蓝色条带变绿；1L0.1%的AgNO3染色30min，水洗3min；1L3%Na2CO3+2ml甲醛+200μl1%Na2S2O3显色5-10min，直到显色满意为止；停显后照相保存相片，收拾清洗。2结果与分析2.1琼脂糖凝胶电泳检测结果及分析图14种提取方法总DNA琼脂糖凝胶电泳图从此图1中可以明显看到4种方法都能提取得到总DNA。但是A、C、D总体来看都有电泳拖尾（说明有DNA在电泳过程中分解），只有B的拖尾是最少的甚至无拖尾。2.2聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果及分析图24种提取方法PCR产物聚丙烯酰胺电泳图从图2中可以看到4种方法都能满足SSR技术的PCR扩增。2.3紫外吸光值检测结果及分析将4种不同方法所提取的12个样品用UV-759紫外分光光度计测量各样品的A260和A280，根据计算得出下表。表14种提取方法总DNA光密度值和产率从表1可以看出4种提取方法提取的DNA产率都在120-170μg/g，其中B种提取方法A260/A280接近于1.8，说明该种方法提取出的DNA比较纯净，杂质含量较少。而其他3种方法A260/A280小于1.8，说明这些方法所提取出的DNA含有其他杂质，DNA纯度比方法B低。2.4实验分析方法A260A280A260/A280DNA产率（ng/g）A10.07240.04171.7362144.8A20.08280.04731.7505165.6A30.06910.03831.8042138.2B10.06980.0391.7897139.6B20.06490.03501.8333129.8B30.07620.04041.8861152.4C10.06190.03561.7389123.8C20.0620.03621.7127124C30.06170.03551.7361123.4D10.06360.03671.733127.2D20.06970.03891.7918139.4D30.07140.03951.8076142.8通过对上述实验结果进行综合分析得到方法B：改良CTAB提取法为珠子参根部DNA提取的最佳方法。因此对不同保存方法的