松针不同提取部位体外抗肿瘤作用的实验研究

松针不同提取部位体外抗肿瘤作用的实验研究周微a，郑晓珂b，王小兰a，冯卫生a（河南中医学院，a．药学院；b．基础医学院，郑州450008）摘要：目的探讨松针不同提取部位的体外抗肿瘤作用。方法采用系统溶剂萃取法将松针醇提物进行部位分离，得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水提取部位，通过四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）观察各提取部位对人肝癌细胞株SMMC-7721、HepG2，人乳腺癌细胞株MCF-7，人前列腺癌细胞株PC-3细胞增殖的抑制作用。采用流式细胞术分析细胞周期分布，初探松针抗肿瘤作用机理。结果石油醚部位对肿瘤细胞的抑制作用较强，在一定剂量范围内呈现出时间和剂量依赖性；乙酸乙酯部位的作用次之；正丁醇和水部位的抑制作用不明显。SMMC-7721细胞经0.6mg·ml-1、0.8mg·ml-1石油醚提取部位处理48h后的凋亡百分率分别为18.7%、21.4%，它对该细胞增殖的抑制是将细胞周期阻滞在G2-M期。结论松针提取物在体外具有抗肿瘤作用，石油醚部位呈现出较强的抑制作用，其体外抑制SMMC-7721细胞增殖的机制可能与松针提取物的细胞毒作用、诱导细胞凋亡和抑制细胞分裂有关。关键词：松针；肿瘤细胞株；MTT法；流式细胞术ExperimentalStudyonAntitumorEffectofDifferentFractionsofPineNeedlesinvitroZHOUWeia,ZHENGXiao-keb,WANGXiao-lana,FENGWei-shenga(HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,a.SchoolofPharmacy;b.BasicMedicalCollege,Zhengzhou450008)Abstract:ObjectiveTostudytheantitumoreffectofdifferentfractionsofpineneedlesinvitro.MethodsPineneedleswereextractedandseparatedbythetechniqueofsolvent-refining.MTTassaywasusedtoobservetheinhibitionofextractsontheproliferationofhumanhepatocellularcarcinomaSMMC-7721,HepG2,breastcarcinomaMCF-7andprostaticcarcinomaPC-3.Apoptosisratesandcellcycledistributionweredetectedbyflowcytometryanalysis.ResultsPetroleumetherextractfrompineneedlespossessestheroleofantitumoreffectincellculture.Theinhibitoryeffectontheproliferationoftumorcellshasremarkabletime-dependenceanddose-dependence.PetroleumetherextractinducesSMMC-7721apoptosisandarrestsinG2-Mphase.ApoptoticpercentageofPetroleumetherextract0.6mg·ml-1and0.8mg·ml-1onSMMC-7721is18.7%and21.4%in48hours.ConclusionPineneedlesfractionshavetheantitumoreffectinvitroandthepetroleumetherextractpossessestheroleofantitumoreffect.AnticancermechanismofpetroleumetherextractonSMMC-7721maybedirectcytotoxiceffect,inducingcellapoptosisandinhibitingcellsegmentation.Keywords:Pineneedles;carcinomacelllines;MTT;flowcytometryanalysis松针(Pineneedles)为松科(Pinaceae)松属(Pinus)植物马尾松(PinusmassonianaLamb.)的针状叶[1]，味苦、涩、性温，归肝肾经。国外许多研究已证实松针具有抗氧化、清除自由基、抑制肿瘤细胞转移、调节免疫系统的功能。本实验室在前期对其化学成分进行了系统研究，已从中得到多个木脂素类、黄酮类化合物[2-8]，并对木脂素类化合物进行了体外抑癌筛选，发现该类成分能抑制多种肿瘤细胞增殖，并呈时间和剂量依赖性。目前有关松针抗肿瘤系统的实验研究报道不多，为此，本文采用MTT法，以体外培养的人肝癌细胞株SMMC-7721、HepG2，人乳腺癌细胞株MCF-7，人前列腺癌细胞株PC-3为模型，考察了松针提取物的体外抗肿瘤作用，并对其作用机理进行初步探讨，为深入研究该植物抗肿瘤活性成分及作用机理奠定实验基础。1实验材料1.1肿瘤细胞株：人肝癌细胞株SMMC-7721、HepG2，人乳腺癌细胞株MCF-7，人前列腺癌细胞株PC-3。由本实验室常规培养于含10%小牛血清的RPMI1640培养基中（含青霉素100U/ml，链霉素100U/ml），置37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，2-3d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。1.2药物与试剂：马尾松松针采自河南伏牛山区；RPMI1640培养基及新生小牛血清(FCS)，Gibco公司；二甲基亚砜（DMSO)及四甲基偶氮唑盐(MTT)，Amresco公司；胰蛋白酶(Trypsin)，Gibco公司；五氟尿嘧啶（5-FU），上海旭东海普药业有限公司，批号060703；碘化丙啶（PI）及RNaseA，Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯。1.3仪器设备：流式细胞仪，COULTEREpicsXL；ELIEⅡ细胞培养箱，美国REVCO公司；SW-CJ-IFD洁净工作台，苏净集团安泰公司制造；KDC-160HR高速冷冻离心机，科大创新股份有限公司中佳分公司；TS100倒置显微镜，日本Nikon公司；酶标仪，美国BIO-RADModel680；超纯水仪，Sartorius611VF；单道可调微量移液器，NichipetEXplus；PHS-3C酸度计，上海精密科学仪器有限公司；培养皿、96孔培养板、细胞冻存管，Corning公司。2实验方法2.1药物制备：干燥马尾松松针1kg，粉碎后以70%乙醇10倍量浸泡过夜，加热连续回流提取2次，每次2h，过滤合并，减压浓缩至稠膏。将稠膏悬浮于适量水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，将萃取液浓缩得各部位，烘干后称重，计算得率。各提取物用适宜溶媒（水或50%乙醇）溶解，调浓度为10mg·ml-1，0.22μm孔径滤膜过滤除菌,4℃冰箱内保存备用。使用时用无血清RPMI1640培养基稀释到所需剂量。2.2松针不同提取部位对肿瘤细胞增殖的抑制作用[9]:收集对数生长期细胞，以含10%FCS的RPMI1640培养液调整细胞密度至5×104个/ml，按每孔180µl加入96孔培养板中，置37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中孵育，细胞贴壁后,实验组分别加入不同稀释浓度的松针提取物20µl，使其终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1mg·ml-1；阳性对照组加入20µl的5-FU，使其终浓度为0.05mg·ml-1；阴性对照组加入等体积的无血清RPMI1640完全培养液,每个浓度设6个复孔(实验重复3次)，连续培养24h、48h和72h。培养结束前4h各孔加入MTT（5mg·ml-1）10µl，继续孵育4h后吸弃上清液，每孔加入DMSO150µl，蓝紫色结晶充分溶解后，在酶标仪上于490nm处测定各孔吸光度（OD）值。按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率:CI=（A-B）/A×100%式中：CI-抑制率，%；A-对照组平均OD值；B-实验组平均OD值。并计算样品的半数抑制浓度IC50。2.3石油醚部位诱导SMMC-7721细胞DNA倍体分析及细胞周期分析：收集对照组和经0.6、0.8、1mg·ml-1石油醚提取物处理48h的SMMC-7721细胞，制成约1×106个/ml单细胞悬液，PBS洗涤后离心沉淀细胞，70%预冷乙醇（0-4℃）固定，500g离心5min，弃上清。悬浮管底的细胞沉淀，在细胞悬液中加2mlPBS，混匀后300g离心5min，弃上清液。留下约50µl的细胞悬液，加100µlRNase溶液，37℃水浴30min。加入800µlPBS、50µlPI染色液，避光染色30min，进行FCM检测，重复3次。2.4统计学方法：采用SPSS13.0统计软件分析，实验数据用平均数±标准差（x±s）表示，实验组与对照组间均数比较采用One-WayANOVO程序进行单因素方差分析。3实验结果3.1药物制备:各提取部位称重分别为12.30g、16.98g、19.30g、46.22g，得率（相对于总提物）分别为10.6%、14.6%、16.6%、39.7%。3.2松针不同提取部位对肿瘤细胞增殖的抑制作用3.2.1对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用：松针石油醚部位在1mg·ml-1时对SMMC-7721细胞作用48h的抑制率达到63.94%，在0.6mg·ml-1时作用72h的抑制率达到50%以上。乙酸乙酯部位在测定浓度范围内对SMMC-7721作用72h的抑制率为50%以上。石油醚部位和乙酸乙酯部位在测定范围内随着药物浓度的增加及作用时间的延长，其抑制率逐渐升高，呈现出时间和剂量依赖性。正丁醇部位和水部位对该细胞的抑制作用变化不明显，仅呈现出时间依赖性，但抑制率均未达到50%（见表1）。Table1InhibitionofdifferentfractionsontheproliferationofhumanhepatocellularcarcinomaSMMC-7721celllines(x±s,n=6)GroupDose/(mg·ml-1)ODCI/(%)24h48h72h24h48h72hControl00.2840±0.011480.4347±0.05170.8047±0.05760005-FU0.050.2051±0.0154﹡﹡0.1879±0.0075﹡﹡0.1952±0.0313﹡﹡27.79±5.422156.77±1.734575.74±3.8857petroleumetherextract0.20.2544±0.0394﹡0.3615±0.0547﹡﹡0.4653±0.0110﹡﹡10.43±13.866316.84±12.585842.17±1.36890.40.2411±0.0319﹡﹡0.3255±0.0213﹡﹡0.4218±0.0257﹡﹡15.10±11.226325.12±4.894847.59±3.19650.60.2410±0.0017﹡﹡0.3065±0.0321﹡﹡0.3253±0.0261﹡﹡15.15±0.609829.48±7.383659.58±3.24680.80.1897±0.0251﹡﹡0.2881±0.0222﹡﹡0.3044±0.0392﹡﹡33.23±8.852935.30±3.897062.17±4.876810.1626±0.0141﹡﹡0.1568±0.0112﹡﹡0.2744±0.0123﹡﹡42.77±4.949163.94±2.584665.90±1.5235aceticetherextract0.20.2095±0.02950.3488±0.0294﹡﹡0.3986±0.0280﹡﹡26.24±10.390219.77±6.767550.47±3.47890.40.1943±0.0207﹡﹡0.2976±0.