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病毒载体研究进展基因载体系统病毒载体系统非病毒载体系统腺病毒载体反转录病毒载体腺伴随病毒载体单纯疱疹病毒载体慢病毒载体裸DNADNA-阳离子脂质复合物DNA-蛋白质复合物细胞内包装细胞外包装DNA-阳离子多聚物DNA/RNA嵌合物吴小兵(‘863’计划生物领域病毒基因载体研发基地)病毒载体概述(1)要求:1、携带外源基因并能包装成感染性病毒颗粒2、介导外源基因转移和表达3、对机体不致病容量:自身基因组大小的105%~110%类型:1、重组型病毒载体2、无病毒基因的病毒载体复制缺陷型可复制型复制缺陷型组成:1、病毒复制和包装元件2、病毒基因3、插入的外源基因或元件4、病毒外壳/外膜用途:基因转移和表达1、基因治疗2、疫苗3、器官移植4、组织工程5、转基因动物6、基因功能研究病毒载体概述(2)优点:1、利用病毒天然的感染性进入细胞,转导效率高;2、复杂的装配过程由细胞完成;3、不同的病毒载体具有不同的表达特点。存在的问题:1、安全性2、靶向性3、有效性细胞毒性染色体毒性免疫毒性转导靶向性转录靶向性转导效率靶向性基因表达水平和持续时间表达的可调控性病毒载体生物学特性适用范围反转录病毒载体单链RNA病毒8~10kb可感染分裂细胞;整合到染色体中;表达时间较长;有致癌的危险;Exvivo基因治疗;肿瘤基因治疗。腺病毒载体双链DNA病毒36kb可感染分裂和非分裂细胞;不整合到染色体中;外源基因表达水平高;表达时间较短;免疫原性强;Invivo基因治疗;肿瘤基因治疗;疫苗。AAV病毒载体单链DNA病毒~5kb可感染分裂和非分裂细胞;整合到染色体中;无致病性;免疫原性弱;可长期表达外源基因;在骨骼肌、心肌、肝脏、视网膜等组织中表达较高;Invivo基因治疗;Exvivo基因治疗;遗传病基因治疗;获得性慢性疾病的基因治疗。HSV病毒载体双链DNA病毒152kb具有嗜神经性;可逆轴突传递;可潜伏感染;容量大;可感染分裂和非分裂细胞;神经系统疾病的基因治疗;肿瘤的基因治疗。常用的病毒载体的特点:病毒载体研究方向1、病毒包装系统2、无病毒基因的病毒载体6、自我扩增型病毒载体7、条件增殖型病毒载体5、嵌合型病毒载体3、靶向性病毒载体4、可调控表达的病毒载体8、新病毒载体病毒载体包装系统组成:1、宿主细胞2、辅助元件(辅助质粒、辅助病毒)3、被包装的DNA/RNA包含顺式作用元件单因素生产系统(one-componentsystem)双因素生产系统(two-componentsystem)gagpolenvLTRLTR图1反转录病毒包装系统示意图图2腺病毒包装系统示意图293cellE1a,bJM17AdShuttle293cellE1a,b多因素生产系统(multi-componentsystem)多因素系统双因素系统图3腺病毒伴随病毒包装系统示意图hostcellHelpervirusHelperplasmidrepcapVectorplasmidHostcell+vectorDNAHelpervirus+helperplasmid图4双因素系统生产重组AAV病毒示意图proviralcellRecombinanthelpervirus(rHSV-repcap)repcap无病毒基因的病毒载体被包装的DNA/RNA中不含任何病毒编码基因,只保留其复制和包装所必需的顺式作用元件。获得的重组病毒颗粒具有野生型病毒的外壳/外膜和感染性,但不表达病毒蛋白。腺伴随病毒载体:反转录病毒载体:腺病毒载体:单纯疱疹病毒载体:LTRLTRgenegeneITRITRpAgeneITRITRpAgenepacorigenegenegenegene无辅助病毒包装系统图5重组AAV无辅毒包装系统adenovirusgeneITRITRaavvectorplasmidE2aE4orf6VAHelperplasmid:293细胞E1a,bcre293-cregeneITRITRAdenoviruswithpackagingsignalflankedbyloxP图6mini-adnovirus无辅毒包装系统靶向性病毒载体转导靶向性转录靶向性(特异性)改造病毒外壳/外膜连接靶向性结合分子Modifiedadenoviruscell组织特异性启动子肿瘤选择性启动子细胞周期调控启动子肿瘤血管内皮导向启动子双特异性启动子病毒增殖的特异性转录调控可调控表达的病毒载体细胞的调控元件病毒的调控元件人工合成的调控元件细胞特异性转录细胞启动子病毒启动子albuminMVMP4TyrosinaseorTRP-1B19promoterPSAHBVMBPJCVMCKEBVGFAPNSEKDR/flt-1AFPCEAerbB2HREMDR1P1tTAtetOpgeneP1tTAtetOpgenetTAtetOpgenetetOp四环素调控合成的转录因子GAL4PRVP16RXREcRVP16FKB12ZFHD-1FRAPP65rapamycinRU486GAL4ERVP16ESTRADIOLGAL4ERp65Diphenolindenemuristerone自我扩增型载体(self-amplifyingvector):这类载体是以正链RNA病毒Sindbis病毒和SemlikiForest病毒为基础的。用目的基因代替病毒的外壳蛋白编码序列,导入靶细胞中,病毒的复制蛋白大量复制重组的基因组,mRNA水平的大量增加导致高水平的转导基因表达。自我扩增型载体的表现形式可以是RNA,DNA和重组病毒。条件增殖型病毒载体(conditionallyreplicatingvector):指可在某种特性的组织中产毒性复制,而在其它组织中不增殖的病毒载体。这类病毒载体主要用于特异性裂解肿瘤细胞。如天然的腺病毒突变株Onyx-015是55KdalE1B基因功能缺失的腺病毒突变株,可以选择性地在p53基因突变的肿瘤细胞中增殖,而在正常组织细胞中不增殖。用这种突变株联合化疗治疗恶性肿瘤II期临床结果令人鼓舞(KirnDetal.1998),已进入III期临床试验,从此,许多人工改造的腺病毒突变体被用于肿瘤治疗研究中。嵌合型病毒载体(hybridviralvector):指将不同病毒的基因元件进行组合,形成的重组杂合病毒。如腺病毒与AAV病毒的杂合体病毒,既具有腺病毒的感染性和基因组特性(双链线状DNA),又具有AAV病毒的染色体整合性(LieberAetal.1999)。各种病毒基因元件组合形成新的杂合载体的报道层出不穷,如单纯疱疹病毒扩增子与AAV病毒杂合载体(JohnstonKMetal.1997)、腺病毒与EB病毒复制子杂合载体(TanBTetal.1999)腺病毒与反转录病毒杂合载体(CaplenNJetal.1999)等,不一而足。这些杂合载体使重组病毒的特性多样化,以适应不同基因转移目的的需要。重组病毒的生产和纯化小量制备和纯化大量制备和纯化场所细胞培养细胞裂解病毒分离病毒纯化制剂保存培养瓶转瓶、细胞工厂、发酵罐反复冻融机械法或化学法裂解实验室中试车间离心离心、超滤、萃取密度梯度超速离心浓缩、柱层析配方缓冲液低温病毒载体与基因治疗产业化基因治疗产品的知识产权构成1、治疗基因2、调控元件3、改造的外壳/外膜4、靶向分子5、包装系统6、生产和纯化技术7、制剂和保存技术产业化的组织和实施:1、合作开发2、专业分工3、政府支持和企业投资4、利益分配基因治疗的三个核心部分1、基因载体系统2、基因表达系统3、治疗基因知识产权和基础研究专利对学术研究的影响1、无影响(对非常早期研究)2、有影响(对临床试验和可能的商业开发)基因治疗领域的知识产权主要通过专利系统来保护对于基因治疗公司最重要的专利是:1、载体系统;2、生产过程;3、整体治疗方案治疗基因和表达系统可以从其它方购买使用权。政府支持对基因治疗产业化的重要作用1、政策上促进基因治疗的科研、临床和商业开发2、资助基因治疗核心技术研究和开发3、资助建立能规模化生产临床级基因载体的中心或基地4、支持从事基因治疗的公司发展新技术、新产品5、促进新的基因治疗公司建立。6、制定规范、高效且符合国情的审批程序。
本文标题:柏杉荚-病毒载体研究进展
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