柑橘无核育种研究进展

柑橘无核育种研究进展摘要：无核水果在国内和国际市场上占据重要地位，越来越受到水果加工产业的欢迎和广大消费者的青睐。至今为止，柑橘通过了许多方法来获得无核的果实，包括芽变选种、辐射育种等传统育种方法，但因工作量大，无法遗传及周期长等因素在无性繁殖植物上的研究工作进展缓慢。随着生物技术的发展，利用基因工程原理与技术对植物进行无核的定向的性状改良，大大提高了果实无核化育种效率。本文对柑橘无核育种的各种方法据进展进行了综述。关键词：无核，传统育种，基因工程无核果实通常是指果实没有种子、只有少量败育种子或种子数量比正常品种少的果实[1]。近年来的研究结果表明，大部分单性结实的无核或少核品种是由于花粉败育、授粉受精不良、胚胎发育及种子形成过程中的某一环节受阻而产生的；而采取调节果实发育过程中的激素平衡、辐射育种、杂交育种或导入无核基因等措施亦可使果实无核。在许多水果中，种子是不受欢迎的特性，因为他们也许有坚硬的纹理、苦味，并在许多情况下积累有害的毒性成分。去除种子在食用水果中是非常被盼望的，目前，无核水果在国内和国际市场上占据重要地位，越来越受到水果加工产业的欢迎和广大消费者的青睐，也给生产者和广大消费者带来了巨大的经济效益。二十世纪60年代以来，国外已逐步将鲜食品种无核化。我国柑橘品种资源丰富，地方良种很多。但栽培的品种很多是有核的，因而影响了商品价值和在国际市场上的竞争力。因此，无核的特性尤其被需要。本文就至今柑橘在无核上的研究进行了综述，涉及机理，途径和方法三个方面，并进行了展望。1柑橘无核化的生理机理柑橘中无核品种主要为甜橙类及温州蜜柑，造成它们无核的主要原因是花粉败育。我国已先后获得100多个无核或少核类型的柑橘品种（品系），涉及柑橘属的主要栽培种类和金柑属﹑黄皮属。过去，芽变选种和实生选种是获得无核或少核类型的主要方法和途径，在已报道的119个无核或少核类型中,芽变选种和实生选种分别占39.5％和42.9％[2]。也有少数品种是用诱变育种或杂交的方法得到的。现在人们尝试利用原生质体融合的方法得到三倍体，从而达到获得无核优良柑橘品种的目的。柑橘无核的机理可以分为以下几个方面：1.1雄性不育绝大部分的无核或少核柑桔品种都与花粉败育有关，而且其雄性不育可通过杂交遗传给后代[3-6]。引起花粉败育的原因有遗传因素，也有环境因素,但后者是不能遗传的。就柑橘花粉发育过程而言，导致雄性不育的遗传因素有很多，主要有：花药败育、花粉母细胞退化、花粉粒退化或染色体异常等。花粉母细胞退化，主要由绒毡层退化、抑制花粉细胞分裂所致，而其花粉退化主要由于小孢子液泡形成期绒毡层的异常而引起的营养缺乏。染色体结构的变异体现在同源染色体不联会、易位、倒位等方面。如少核红江橙变异株系，花粉育性只有原母树的30%左右[2]，伏令夏橙在第一次分裂中期染色体相互易位[7]。温州蜜柑花粉粒退化，温州蜜柑的不育性可以遗传给后代，利用它与其它品种杂交得到不少不育类型。关于花粉败育的内在生理机制，许多人认为，可能与花药内游离脯氨酸的含量有关，在辣椒[8]，水稻[9]，小麦[10]等不育系中，检测游离脯氨酸含量明显低于对照；但也有研究者认为，脯氨酸含量的变化是花粉败育的结果，或二者不存在因果关系，是同一原因造成的两种现象[11]。Palif等[12]人认为，花药内游离脯氨酸含量与其育性呈正相关，并提出它是花粉粒及花粉育性的衡量指标。但是，陈桂信认为，蕉柑成熟花药游离脯氨酸含量的相对缺乏与花粉败育之间不是一种因果关系，而是两种现象同时发生的一种平行关系。关于雄性不育的机理尚需进一步探明。1.2雌性不育1.2.1胚囊败育胚囊是柑橘雌性器官的重要组成部分，胚珠的发育与胚囊的育性关系密切，当胚囊不育或部分不育时，胚珠就不能发育或是部分发育成种子，从而产生无核或少核果实。胚囊败育主要表现在珠被或珠孔发育异常、胚乳核分裂异常、胚乳中途退化、大孢子分裂异常(包括四核或八核时期的卵细胞、极核、助细胞和反足细胞发育异常)等方面。许多柑橘品种都具有不同程度的胚囊不育现象，因为成熟果实内的种子数常比胚珠数目少得多。华盛顿脐橙、伏令夏橙、哈姆林甜橙、温州蜜柑马叙无核葡萄柚等的无核或少核性，除与花粉高度不育有关外，还与胚囊不育密切相关，这些品种的胚囊败育高峰期都在胚囊的四核期，此外在大孢子期和胚囊的二核期及八核期也都发生类似的败育现象。这种遗传的胚囊不育特性同样可以传递给后代。但是，胚囊不育导致无核又是杂交育种的一个障碍，因为如以胚囊不育品种作母本，即使以健全的花粉授粉，也很难得到杂交种子，这样，必须加大杂交数量，才可能得到一定数量的杂交种子和遗传了胚囊不育特性的杂种后代[7]。Chen等[13]人认为，桂林良丰无核桠柑胚囊在形成前后大量败育退化。而蕉柑大孢子发生发育过程比正常品种明显滞后，其胚珠和胚囊在发育过程中陆续出现严重的败育现象心[14]。1.2.2胚乳败育在柑橘受精时的胚囊，通常只有很少的营养物质，胚乳总是先于胚的发育，为幼胚生长提供条件。胚的生长只有当胚乳正常发育才能进行，如果胚乳败育，胚发育也停顿。有报道表明，胚乳退化继而诱发胚胎中途败育，是最终导致了无核蜜香柚[15]和“塔1”无核芦柑突变体[16]的形成的原因。1.3自交不亲合自交不亲和，主要表现在花粉落于柱头上不萌发，或即使形成花粉管，花粉管的生长缓慢，也不能适时进入胚囊。从而无法完成受精过程，这是那些具有单性结实能力的树种或品种产生无核的原因之一[11]。在柑橘中，由自交不亲合造成的无核，表现出花粉和胚囊的形态及育性均正常。橙子Keraji品种出现的无核或少核果实是由该品种的雌性不育性、自交不亲和性和单性结实引起的[17]；日本通过杂交选育的清见柑桔具有花药退化、自交不亲和、单性结实强等优良性状[18]；宽皮橘中的克可迈丁橘是有名的自交不亲和品种，以其作亲本的杂种后代也常表型出自交不亲合类型；另外，鲁滨逊橘、李橘、佩奇橘柚、诺瓦橘柚等，也是自交不亲合类型；多数柚类的无核品种也都是自交不亲和类型。关于柑桔自交不亲和的遗传机理，大多数研究者认为，主要因为复等位基因的控制，即具有相同基因型的雌雄配子不能结合[19]。2柑橘无核育种的途径2.1芽变选种和实生选种芽变是体细胞突变的一种，突变发生在芽的分生组织细胞中，当芽萌发成枝条，并在性状上表现出与原类型有所不同，就是芽变。在自然授粉产生的种子播种后形成的实生群体中，采用一定的选择方法获得新品种的方法称为实生选种。柑橘中存在着广泛的变异，特别是在发生自然灾害后，老年树体会发生一些有益的变异。无核突变是无核柑橘品种的主要来源。现有的无核、少核品种大多数都是来自于有核品种的芽变或珠心胚实生变异。如少核红橘“宣南一号”、黔阳无核大红甜橙等。2.2辐射育种人工诱变是诱导无核突变的又一手段。柑橘辐射育种的历史不长，1935年才有人利用x射线进行柑橘诱变。1970年，美国Hensz从热中子处理哈德逊葡萄柚种子的实生后代中，选出了无核、红肉的星红玉(StarRuby)葡萄柚。我国柑橘辐射育种工作开始于20世纪60年代。通过辐射诱变育种得到了红江橙[20]、雪柑[21]等的无核或少核的突变体。黄建昌等[22]人应用60Co-λ射线辐射处理红江橙、暗柳橙[23]和沙田柚[24]的接穗，试验结果表明：由于辐射诱发染色体联会消失，染色体变异，分裂不正常，导致花粉和胚胎败育，致使花粉败育，产生二倍体水平的无核突变。李庄等[25]人在使用RAPD技术证明有核沙田柚经辐射诱变后形成无核沙田柚时，发现基因组已发生明显变异。近年来，辐射育种已经向细胞和分子水平发展。对离体培养的愈伤组织进行诱变处理，进而选择所需目标性状的优良突变体。但是，辐射诱变的缺点是获得无籽品种的不确定性和偶然性较高。也可通过化学诱导染色体突变获得无核株系，陈大成[26]等人用秋水仙碱处理十月桔、沙田柚等6个品种的茎尖，仅获得了突变性稳定的四倍体十月桔，其种子数由原来二倍体的15--20粒减少至近无核；李传生等人[27]用同样的方法获得了四倍体少核金柑。2.3杂交育种由于柑橘存在多胚现象和有性胚败育现象，有性胚与珠心胚难以区别，因而其杂交育种较其它果树难度更大。为了解决这些难题，人们采用了很多方法提高杂种获得率，并努力探索各种途径，来寻找一种简便准确而实用的方法来鉴别区分杂种苗和珠心苗。在柑橘中可以通过有核与无核品种的杂交，综合双亲控制的包括无核性状在内的多个有利基因。经常利用温州蜜柑、脐橙等遗传性花粉败育品种与其它柑橘品种杂交，可在后代中分离出花药退化的高度雄性不育类型。2.4三倍体育种凡是染色体数目的倍数大于基数(单倍体)3倍的都称为多倍体(polyploid)；植物界野生种中约有1／3的是多倍体[28]。多倍体尤其是奇数多倍体，由于同源染色体在减数分裂时无法平均地分配到配子中去，因而染色体失去平衡，由于三倍体减数分裂不正常，形成的配子缺乏生活力而不易形成种子，同时柑橘具有单性结实特性，可以形成无核果实，因此培育三倍体是得到无核柑橘类型的一个重要途径。1）直接从柑橘二倍体品种的小粒种子中选育出柑橘三倍体，这些充实饱满的小粒种子大小为正常种子的1/6～1/3，而且大多数为三倍体[29,30]；2）胚乳培养是获得柑橘三倍体的另一途径，因柑橘胚乳本身就是三倍体，因而可以直接用来培育三倍体；3）利用细胞融合技术获得三倍体植株。利用细胞融合技术得到柑橘四倍体，然后再与二倍体品种杂交得到三倍体植株。也可以利用柑橘四分体小孢子原生质体与体细胞原生质体融合获得三倍体[31]。2.5基因工程的方法通过基因工程的方法得到无核柑橘品种的研究，近几年开展得较多，并显示了很好的应用前景。此外，还有一些研究二倍体花粉或二倍体胚，希望只通过授粉就可以得到三倍体果实，而实现得到优良无核柑橘的目的。邓秀新等以异源四倍体花粉对沙田柚授粉，得到了瘪籽的沙田柚果实[32]。3利用基因工程获得无核果实的研究进展无核果实是鲜销水果的首选优势性状，为广大消费者所喜爱。传统上，可通过选育天然单性结实和刺激性单性结实品种来实现无核化栽培。但因工作量大，无法遗传及周期长等因素在无性繁殖植物上的研究工作进展缓慢。随着生物技术的发展，利用基因工程原理与技术对植物进行无核的定向的性状改良，大大提高了果实无核化育种效率。3.1雄性不育基因工程的研究进展雄性不育，是指生理上或遗传上的原因造成植物花粉败育，而雌蕊正常，仍能接受外来花粉的特性。根据遗传特性，雄性不育可分为细胞核不育(Genomemalesterility，GMS)和细胞质不育(CytoplasmicMaleSterility．CMS)。GMS受核基因控制，CMS受细胞质和细胞核遗传物质的双重控制。从雄性不育现象已经在很多植物中发现，虽然雄性不育相关因子的位置结构功能等人们还没有研究得很清楚，但是近十几年来，随着细胞分子生物学和分子生物学理论和技术的发展，人们对植物雄性不育的相关机理的研究推上了一个新台阶。由于细胞器分离技术、限制性内切酶技术、分子标记技术、基因克隆和序列分析技术的发展，人们对植物雄性不育现象的特征和遗传规律及其作用机理逐渐有所认识。近十几年来，应用基因工程创造雄性不育植株已经在很多植物上进行并取得了一定的进展。3.1.1利用基因工程创造雄性不育植株的主要策略目前利用基因工程创造雄性不育主要是利用花粉发育的特异启动子与外源基因嵌合，构建表达载体，转化植物来阻断花粉发育的过程从而达到雄性不育的目的。这些特异的启动子主要包括：①在绒毡层中特异表达的基因：烟草的TA29，金鱼草的tap2基因[33]，水稻的0sg6B[34]，拟南芥的蛋白酶抑制剂A9基因[35]；②在花药中特异表达的基因:拟南芥和油菜的APG基因[36]。③在花粉中特异表达的基因如：玉米的Zm13(蛋白酶抑制剂)[37]、CDPK（钙依赖型蛋白激酶）[38]；番茄的LAT52[39]和LAT59[40]；油菜Bp4、I3、E2和F2s[41]。利用基因工程创造雄性不育的策略主要分为以下几种：第一、特异表达细胞毒素基因创造雄性不育系绒毡层是显花植物花粉发育