新型的血小板容器与聚烯烃容器的比较

TransfusionMedicine,2000,10,131-139新型的血小板容器与聚烯烃容器的比较E.H.Kostelijk,C.W.N.Gouwerok,H.A.VeldmanandD.deKorteDivisionCLBofSanquinBloodSupplyFoundation,Amsterdam,TheNetherlandsReceived16June1999;acceptedforpublication5October1999概要：在血小板浓缩液存储过程中，血小板质量会逐步下降，一部分依赖于气体交换情况。UPX80(JMS,日本)1LPVC血小板容器提高了气体传送能力，与1和1.5L聚烯烃(PO)容器(NPBI,荷兰)相比较：装入过滤去白的PCs，以GAC(葡萄糖-醋酸盐-柠檬酸盐,10%血浆)或血浆为保存介质，保存八天。共制备32份PCs(260-330×109血小板/浓缩液)，均等的装进不同的保存袋和保存介质。在存储期间，检验气体交换、代谢、物理和活性等参数。对UPX80和PO保存袋(1或1.5L)所有参数进行观察不存在一致的差异。血气参数显示UPX80保存袋比PO保存袋有更好的气体交换能力。UPX80显示出良好的形态参数，与PO容器相比在代谢能力上两者没有明显差别。在长时间（六天后）的储存后,一些差异在CD62P和CD63表达上被发现,表明在UPX80保存袋里有更高程度的血小板活化,尤其是在GAC里。UPX80PC容器更适用于存储PCs。虽然证明了UPX80有更好的气体交换能力,相比PO容器,这并不能提高血小板保存6天的质量,表明气体交换水平在PO容器之上后就不再影响血小板进行有氧新陈代谢。关键词：血小板浓缩液，PO容器，存储，UPX80容器。在血小板输注前能够存储数天对于血小板输注的流通使用有很大好处。虽然有几种类型保存袋的存储时间能够超过5天,但是因担心细菌污染其最大存储时间也就仅限于5天（Morrow等，1991；欧洲理事会，1999）。在存储过程中，血小板质量的保存极大地依赖于气体如二氧化碳和氧气的充分交换(Murphy&Gardner,1975;Rocketal.,1981)。高的氧气渗透性能诱导有氧代谢，比厌氧条件下糖酵解产生更少的乳酸。此外,葡萄糖或醋酸盐代谢过程中产生的二氧化碳也可以Correspondenceto:DrD.deKorte,CLB/Sanquin,Plesmanlaan125,1066CXAmsterdam,TheNetherlands.Tel.:[phone];fax:[phone];e-mail:[e-mail]酸化介质。因此,高的二氧化碳渗透性是必要的。从理论上说，过高的气体交换，可导致过高的pH值（7.4），对血小板体外质量有负面影响(Solbergetal.,1986)。然而,Bannai等(1985)指出高的pH值在轻轻搅动时会有最小负面影响，如使用摇床设备。新容器已开发出来以改善血小板在储存过程中的质量(Wallvik&Akerblom,1983)。在这项研究中，增加了表面积的血小板保存袋UPX80由JMS(广岛,日本)制造，使用PVC合用长链增塑剂（双十一烷基邻苯二甲酸酯）制成的；将它与聚烯烃（PO）(Compoflex,NPBI,EmmerCompascuum,theNetherlands)制成的保存袋进行测试和比较。新容器添加增塑剂和增加表面积可以增加气体交换(Kakaiya&Katz,1984)。依据UPX80制造商将它与普通PVC（气体渗透率设定为100%）透气性的比较结果，这种材质能提高氧渗透率至360%，二氧化碳渗透率至400%。对于PO保存袋做了一个类似的比较，能增加氧渗透率至260–310％，二氧化碳渗透率210–230％。因此UPX80相比PO有1.16–1.38倍O2渗透性、1.73–1.93倍CO2渗透性。PO保存袋已经被广泛用于血小板保存并有令人满意的结果(Boomgaardetal.,1994)。新的1000毫升UPX80制造商的说明书上显示，它们可维持每200–400毫升血浆含血小板数在3.0和6.0×1011之间。制造商表明UPX80（双十一烷基对苯二甲酸酯）毒性比常用PVC容器增塑剂邻苯二甲酸二乙基己基酯（DEHP）低。UPX80的雄性大鼠半数致死量是978.710mgkg-1,而DEHP的半数致死量是250mgkg-1（个人通信,DrSuzuki，JMS，广岛，日本）。我们测试气体交换参数和血小板活化敏感指标的一组扩展质量参数，并比较1-LUPX80容器与两个不同容积（1L和1.5正常容积）的PO保存袋。UPX80保存袋在血浆和合成基质（GAC，葡萄糖酸盐–醋酸盐–柠檬酸盐）中保存血小板有八倍效果。由于PO众所周知的特性（Boomgaard等,1994年,1995年）,这种保存袋每个体积（1L和1.5）都达到四倍效果。每个体积的保存袋测试时四份PCs保存在血浆里，四份保存在GAC。材料和方法准备PCs本次研究准备了四组实验，每组实验包含八份PCs。在每组实验里，从正常献血者收集40份全血（500±50mL，阳性血型）,使用PVC-DEHP顶底袋并加入70ml柠檬酸盐–磷酸盐–葡萄糖（CPD）保存液（T&B,Biopack,CompofiexNPBI,Emmer-CompascuuÈm,TheNetherlands)。收集完毕，全血在28℃下使用丁二醇冷却板冷却贮存过夜（Pietersz&deKorte，1989），直到第二天（保存第0天,记作d0）汇集白膜（BCs）制备PCs。对全血进行离心（8分钟，2817g，brake3，启动时间70s，停下时间约270秒；HettichRotoSilentaR/P,DeÂpex,DeBilt,荷兰)。离心后，使用CompomatG4全自动血液成分分离机收集BCs；该设备带有Compomaster软件系统(NPBI)。五份BCs汇集合成为一份PCs。血浆或GAC（葡糖酸盐，醋酸盐，柠檬酸盐：90mMNaCl,23mM葡萄糖酸钠,27mM醋酸钠,5mMKCl,3mMMgCl2,0.32%(w/v)柠檬酸三钠,294mosm,pH7.4)加入到BC汇集液至总重量达到500克。用于每组的介质类型。汇集在血浆中的BC离心5min（704g，brake3,20℃）；汇集在GAC中的BC离心5min（313g，brake3,20℃）。富血小板上清液转移到一个转移袋。然后用SepacellPL-10A过滤器（Asahi，日本）在10分钟的准备时间内将PC过滤和存储在UPX80血小板保存袋（JMS1000，JMS，日本广岛）（每步做4个）或PO保存袋（Compofiex，NPBI），PO保存袋有1.5或1L公称容积两种规格（每种规格在每组里做4个）。计算PC汇集液的体积，用其净重量除以血浆密度(1.026g/cm3)或血浆含量少于10%的GAC的密度(1.002g/cm3)。PC储存和取样浓缩液储存在一个带有水平摆动振动器(1周/s)(HelmerlabsInc,Noblesville,IN,USA)的血小板培养箱(22±2℃)内。在第0天(PC制备完成过滤后即收集全血约16h后立即取样)，第1、3、6、8天用取样点耦合器(NPBI)在无菌环境下取样。血小板和白细胞计数在用PBS稀释(1:4)后使用电子计数仪(AcT10,CoulterElectronics,Mijdrecht,TheNetherlands)对每份PC液中的血小板和白细胞进行计数。过滤后，滤液用PBS（含吖啶橙2.5mg/L）以1:5进行稀释;白细胞用亮线型白细胞计数板(Superior,BadMergentheim,Germany)在荧光显微镜(Leitz,Wetzlar,Germany)下进行计数。血气参数五分钟内取样完毕，用血气分析仪(CibaCorning238pH/BloodGasAnalyser,ChironDiagnosticsNV,Houten,TheNetherlands)测量取样PCs的血气值(pH,pCO2,pO2)。测量过程在37℃进行。涡旋模型和血小板染色形态涡旋模型由Fratantoni等在1984年确定，由两个相互独立的过程完成。如果涡旋可见不均匀性存在于整个血袋，对比度精细，此时定涡旋值定为3。同样情况但没精细对比定为2，只有一些地方存在可见不均匀性并对比度差定为1。在对保存袋挤压前后都没不均匀性存在设定为0。至于血小板形态的测定，50μLPC与250μL戊二醛液(0.5%溶于PBS,v/v)相混合后4℃保存。测形态的样本最多能保存4天，检测方法使用Kunicki等(1975)稍作改进检测方法，使用油浸过的光学显微镜（Leitz)(1000×)。一共检测记录100个血小板：完美光盘状和几乎平的血小板（含树突）记作4，充满树突的记作2，球状的记作1。核苷酸含量和碱基释放用之前所述的高氯酸提取法(deKorteetal.,1985)提取血小板核苷酸，然后用阴离子交换HPLC法测其含量。中性样本溶液在用HPLC检测分析前储存在–80℃条件下。事先填充PartispherePartisil-5SAX系列色谱柱(125×4.6mminternaldimensions,Whatman,Clifton,NY,USA)。通过碱基的释放来衡量核苷酸的降解是通过反相高效液相色谱法(vanGennip等，1987)分析测量离心(12000g,5min)后高氯酸上清液的次黄嘌呤、黄嘌呤、尿酸、腺嘌呤和腺苷的含量来完成的。C18色谱柱使用Partisphere5C18柱（125×4.6mminternaldimensions,Whatman）.不同物质的浓度是通过与高纯度的标准品比较得到的(SigmaChemicalCo.,StLouis,MO,USA)。活性相关性抗原为了测试血小板的活性，使用了前面所述的（Fijnheeretal.,1990;Boomgaardetal.,1995）下列针对人类血小板抗原的小鼠单克隆抗体（MoAbs)：抗体CLB-Thromb/7对应GPIIb(CD41抗原),抗体Y2对应GPIIIa(CD61抗原),抗体CLB-Thromb/6对应P-selectin(CD62P),抗体CLB-gran/12对应蛋白53-kDa(CD63抗原)和抗体MoAbCLBCD42b(来自于CLB,Amsterdam,TheNetherlands).葡萄糖和乳酸浓度测之前所述(Dolhofer,1976)PC上清液(12000g,5min)的葡萄糖和乳酸浓度。β-血栓球蛋白释放和蛋白质浓度PC上清液用于蛋白质定量检测和β-TG分析。PCs以12000转/秒离心5min，分离上清液，–80℃温度下保存直到分析使用时。β-TG释放量的检测使用RIA(KodakClinicalDiagnosticsLtd,Amersham,UK)，蛋白质浓度的检测使用BCA蛋白质检测仪(Pierce,Rockfield,IL,USA)。计算每份血小板的β-TG浓度。蛋白质浓度用于计算存储于GAC中PC的血浆百分比。可溶性P选择素浓度检测PC上清液(12000g,5min)中可溶性P选择素并用ELISA双抗体夹心法(Kostelijketal.,1996)进行定量测量。使用两个非竞争性的单克隆抗体，其中之一被生物素化。sP-选择素通过免疫吸收从血浆中提纯并作为标准。计算每份血小板的可溶性P选择素浓度。统计分析进行统计分析，使用双尾学生T检验进行成对和不成观测，如果显著(P0.05)则存在差异。在适当的时候，依据Holm(1979)方法对多重比较的显著性水平进行调整。同一检验中多重T检验误差如果低于0.05则表示存在显著性差异。结果以平均±标注差表示，但没合并图表中的误差线以避免混淆重叠的范围。相反，我们控制水平在变异系数（CV）的范围内，得到变化参数的表达。文中提到的相关统计差异。