志鸿同步测控设计2015-2016学年人教版生物选修一课件52多聚酶链式反应扩增DNA片段

-1-课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段-2-课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段首页XINZHIDAOXUE新知导学ZHONGNANTANJIU重难探究DANGTANGJIANCEI当堂检测学习目标思维脉络1.理解PCR的原理,并与细胞内的DNA复制进行比较。2.了解PCR技术操作过程及注意事项。3.能用PCR仪扩增DNA,并估算DNA含量。4.了解PCR的应用。-3-课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段首页XINZHIDAOXUE新知导学ZHONGNANTANJIU重难探究DANGTANGJIANCEI当堂检测一二一、PCR原理及反应过程1.细胞内DNA复制的条件参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶打开DNA双链DNA母链提供DNA复制的模板4种脱氧核苷酸合成子链的原料DNA聚合酶催化合成DNA子链引物使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸2.子链延伸方向通常将DNA的羟基末端称为3'端,磷酸基团末端称为5'端。DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸。-4-课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段首页XINZHIDAOXUE新知导学ZHONGNANTANJIU重难探究DANGTANGJIANCEI当堂检测一二3.人工控制DNA复制的条件在80~100℃的温度范围内,DNA的双链分开,称为变性。当温度缓慢降低后,DNA链又会重新结合成双链。PCR利用了DNA的热变性原理,通过控制温度来控制双链的解聚与结合。PCR过程的温度高,导致DNA聚合酶失活,后来耐高温的DNA聚合酶的发现和应用,大大增加了PCR的效率。4.PCR反应的条件PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行,需提供:DNA模板,分别与两条模板链结合的两种引物,四种脱氧核苷酸,耐热的DNA聚合酶,同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。5.PCR的反应过程PCR一般要经历三十多次循环,每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。从第二轮循环开始,上一次循环的产物也作为模板参与反应,并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合,进行DNA的延伸,这样,DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列,使这段固定长度的序列呈指数扩增。-5-课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段首页XINZHIDAOXUE新知导学ZHONGNANTANJIU重难探究DANGTANGJIANCEI当堂检测一二判一判判断正误(1)体内DNA合成不需要引物,PCR反应需要引物。()提示:×体内DNA合成与PCR反应都需要引物。(2)DNA的合成方向总是从子链的3'端向5'端延伸。()提示:×DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸。(3)PCR通过控制温度来控制双链的解聚与结合。()提示:√(4)PCR要用耐高温的DNA聚合酶。()提示:√(5)PCR分为变性、复性和延伸三步。()提示:√-6-课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段首页XINZHIDAOXUE新知导学ZHONGNANTANJIU重难探究DANGTANGJIANCEI当堂检测一二二、实验操作和操作提示1.实验操作在实验室中用微量移液器,按PCR反应体系的配方在微量离心管中依次加入各组分,然后设计好PCR仪的循环程序,运行即可。2.操作提示为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份,并在-20℃储存。在向微量离心管中添加各反应成分时,移液器上的枪头必须更换。-7-课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段首页XINZHIDAOXUE新知导学ZHONGNANTANJIU重难探究DANGTANGJIANCEI当堂检测一二练一练1.PCR过程中变性温度为()A.94℃B.72℃C.50℃D.80℃解析:在PCR过程中,当温度上升到90℃以上时,双链DNA解聚为单链,称为变性,下降至50℃左右时,引物与单链DNA结合,温度上升至72℃左右时,合成新的DNA链。答案:A2.TaqDNA聚合酶特点是()A.耐强酸B.耐强碱C.耐高温D.最适温度37℃解析:PCR技术中要在90℃以上使DNA变性从而解开双螺旋,因此在该反应中的酶要能忍耐90℃左右高温,1966年,在美国黄石公园找到的水生耐热细菌中分离出的耐高温的TaqDNA聚合酶恰好满足了该条件。答案:C-8-课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段首页XINZHIDAOXUE新知导学ZHONGNANTANJIU重难探究DANGTANGJIANCEI当堂检测一二3.DNA扩增过程中,DNA片段经若干次扩增,与其数目的理论值变化相符的图是()解析:DNA扩增过程中,DNA以指数形式增长。答案:C-9-课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段首页XINZHIDAOXUE新知导学ZHONGNANTANJIU重难探究DANGTANGJIANCEI当堂检测一二4.下列不属于PCR技术的优点的是()A.简单,易于操作B.原理复杂C.实用性强,灵敏度高D.快速、高效,并可自动化解析:PCR技术原理很复杂,但操作却十分简单,快速、高效、灵活和易于操作是PCR的突出优点。答案:B5.PCR技术的操作步骤依次是()A.高温变性、中温延伸、低温复性B.高温变性、低温复性、中温延伸C.中温延伸、高温变性、低温复性D.中温延伸、低温复性、高温变性解析:PCR技术的操作步骤是高温变性、低温复性、中温延伸。答案:B-10-课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段首页XINZHIDAOXUE新知导学ZHONGNANTANJIU重难探究DANGTANGJIANCEI当堂检测探究点一探究点二体内DNA复制与PCR反应的比较问题导引从马航失事到亚航失联再到台湾客机坠毁,2014年到2015年初,较多的重大空难事故给很多家庭带来了巨大的毁灭和创伤。要想确认乘客身份,需要对乘客的遗体进行DNA检测。在检测过程中,如何对采集到的DNA样本进行大量扩增?提示应用PCR技术。-11-课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段首页XINZHIDAOXUE新知导学ZHONGNANTANJIU重难探究DANGTANGJIANCEI当堂检测探究点一探究点二名师精讲体内DNA复制PCR不同点场所细胞内细胞外能量ATP提供能量不需ATP提供能量酶解旋酶、DNA聚合酶等耐高温的TaqDNA聚合酶是否有转录伴有转录,产生引物无转录,需加入两种引物特点边解旋边复制,半保留复制体外迅速扩增循环次数受生物体自身控制30多次缓冲液不需要需要设备无需严格控制温度变化的温控设备相同点原料4种脱氧核苷酸复制原理严格遵循碱基互补配对原则模板DNA引物都需要与模板相结合的引物-12-课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段首页XINZHIDAOXUE新知导学ZHONGNANTANJIU重难探究DANGTANGJIANCEI当堂检测探究点一探究点二典例提升1PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比,主要有两点不同,它们是()①PCR过程需要的引物是人工合成的DNA单链②PCR过程不需要DNA聚合酶③PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶,而是通过对反应温度的控制来实现的④PCR过程中,DNA不需要解旋,直接以双链DNA为模板进行复制A.①④B.①③C.②③D.②④解析:PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比,主要有两点不同:第一,PCR过程需要的引物是人工合成的DNA单链,其长度通常为20~30个脱氧核苷酸;第二,PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶,而是通过对反应温度的控制来实现的。答案:B-13-课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段首页XINZHIDAOXUE新知导学ZHONGNANTANJIU重难探究DANGTANGJIANCEI当堂检测探究点一探究点二变式训练1下列有关PCR反应的叙述,正确的是()A.PCR反应所需要的引物只是RNAB.PCR反应所需要的原料是核糖核苷酸C.PCR反应所需要的酶在60℃会变性D.PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行解析:PCR反应需要的引物是DNA或RNA,反应所需要的原料是脱氧核苷酸,PCR所需要的酶是耐高温的,在60℃不会变性。答案:D-14-课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段首页XINZHIDAOXUE新知导学ZHONGNANTANJIU重难探究DANGTANGJIANCEI当堂检测探究点一探究点二PCR反应过程与实验操作问题导引PCR技术的影响不仅仅局限于生物科学领域,几乎人人都可以感受到PCR所带来的改变,在亲子鉴定以及犯罪调查等方面PCR技术都有广泛应用。而人类基因组计划,这一具有划时代意义的测序工程,如果缺少了PCR技术手段根本无法开始。标准PCR过程一般分为哪几个步骤?提示PCR过程一般分变性、复性、延伸三大步骤。-15-课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段首页XINZHIDAOXUE新知导学ZHONGNANTANJIU重难探究DANGTANGJIANCEI当堂检测探究点一探究点二名师精讲1.PCR的反应过程(1)变性:当温度上升到90℃以上时,双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA。(2)复性:当温度下降到50℃左右时,两种引物通过碱基互补配对原则与两条单链DNA结合,形成局部双链。DNA双链单链(3)延伸:温度上升到72℃左右时,在TaqDNA聚合酶的作用下,以溶液中的4种脱氧核苷酸为原料,从引物的3'端开始延伸,根据碱基互补配对原则合成与模板链互补的DNA链。-16-课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段首页XINZHIDAOXUE新知导学ZHONGNANTANJIU重难探究DANGTANGJIANCEI当堂检测探究点一探究点二2.PCR反应过程图解-17-课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段首页XINZHIDAOXUE新知导学ZHONGNANTANJIU重难探究DANGTANGJIANCEI当堂检测探究点一探究点二3.PCR反应的操作步骤(1)准备:按PCR反应体系的配方将所需试剂摆放在实验台上。(2)移液:按配方用微量移液器向微量离心管中加入各组分。(3)混合:盖严离心管的盖子(防止在实验中脱落或液体外溢),用手指轻弹管壁,使反应液混合均匀。(4)离心:将微量离心管放在微量离心机上,离心约10s,使反应液集中在试管底部,以提高反应效果。(5)反应:将离心管放入PCR仪中,设置程序进行反应。-18-课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段首页XINZHIDAOXUE新知导学ZHONGNANTANJIU重难探究DANGTANGJIANCEI当堂检测探究点一探究点二4.结果分析与评价(1)理论上DNA扩增数目的计算。DNA扩增与DNA复制类似,呈指数扩增。若只有一条DNA模板链,则复制n次后有2n条DNA链;若一开始有a条模板链,则复制n次后有a×2n条DNA链。(2)实验中DNA含量的测定。DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰,峰值的大小与DNA的含量有关。可以利用DNA这一特点进行DNA含量的测定,具体方法如下。①稀释:2μLPCR反应液,加入98μL蒸馏水,即将样品进行50倍稀释↓②对照调零:以蒸馏水作为空白对照,在波长260nm处,将紫外分光光度计的读数调节至零↓③测定:取DNA稀释液100μL至比色杯中,测定260nm处的光吸收值↓④计算:DNA含量(μg/mL)=50×(260nm的读数)×稀释倍数-19-课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段首页XINZHIDAOXUE新知导学ZHONGNANTANJIU重难探究DANGTANGJIANCEI当堂检测探究点一探究点二5.PCR扩增需要注意的问题(1)DNA复制需要引物的原因:DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,而只能从3'端延伸DNA链。PCR中,引物长度通常为20~30个核苷酸。(2)当PCR反应体系的温度冷却到50℃左右时,引物与模板可结合,一般不需要考虑解开的两个DNA模板链的重新结合,原因是:①模板DNA链比引物长得多而且复杂得多,不易重新结合;②引物和模板之间的碰撞机会远远高于模板互补链之间的碰撞机会;③加入的引物的量足够大,而模板链数量少。(3)为避