转录组学主要技术与应用研究

...参考学习转录组学主要技术及其应用研究姓名：梁迪专业：微生物学年级：2013学号：3130179二零一四年六月十五日...参考学习转录学主要技术及其应用研究摘要：转录组(transcriptome)是特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的集合。转录组学研究能够从整体水平研究基因功能以及基因结构，揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理。目前，转录组学研究技术主要包括两种：基于杂交技术的微阵列技术（microarray)和基于测序技术的转录组测序技术，包括表达序列标签技术（ExpressionSequenceTagsTechnology，EST）、基因表达系列分析技术（Serialanalysisofgeneexpression，SAGE）、大规模平行测序技术（Massivelyparallelsignaturesequencing，MPSS）、以及RNA测序技术（RNAsequencing，RNA-seq）。文章主要介绍了以上转录组学主要研究技术的原理、技术特点及其应用，并就这些技术面临的挑战和未来发展前景进行了讨论，为其今后的研究与应用提供参考。关键词：转录组学；微阵列技术；转录组测序技术；应用StudyonthemaintechnologiesoftranscriptomicsandtheirapplicationAbstract:Thetranscriptomeisthecompletesetoftranscriptsforcertaintypeofcellsortissuesinaspecificdevelopmentalstageorphysiologicalcondition.Transcriptomeanalysiscanprovideacomprehensiveunderstandingofmolecularmechanismsinvolvedinspecificbiologicalprocessesanddiseasesfromtheinformationongenestructureandfunction.Currently,transcriptomicstechnologymainlyincludesmicroarry-basedonhybridizationtechnologyandtranscriptomesequencing-basedonsequencingtechnology,involvingExpressionsequencetagstechnology,Serialanalysisofgeneexpression,MassivelyparallelsignaturesequencingandRNAsequencing.Thedetailedprinciples,technicalcharacteristicsandapplicationsofthemaintranscriptomicstechnologiesarereviewedhere,andthechallengesandapplicationpotentialsofthesetechnologiesinthefuturearealsodiscussed.Thiswillpresenttheusefulinformationforotherresearchers.Keywords:transcriptomics;microarray;transcriptomesequencing;application随着后基因组时代的到来，转录组学、蛋白质组学、代谢组学等各种组学技术相继出现，其中转录组学是率先发展起来以及应用最广泛的技术[1]。...参考学习1转录组和转录组学转录组概念是最先由Veclalesuc和Kinzler等人于1997年提出[2]。转录组(transcriptome)广义上是指某个组织或细胞在特定生长阶段或生长条件所转录出来的RNA总和，包括编码蛋白质的mRNA和各种非编码RNA，如rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA、microRNA及其他非编码RNA等。但狭义上通常仅以mRNA为研究对象。由转录组的定义可见，其包含了特定的时间和空间限定，这与基因组的概念不同。因此，同一组织或细胞在不同生长条件、生长阶段，其转录组是不同的。通过遗传学中心法则我们可以知道，遗传信息的传递是以信使RNA（mRNA）为“桥梁”，从DNA传递到蛋白质。由此可见，转录组的研究不仅可以解释细胞或组织的基因组的功能元件，揭示分子成分，还可以用来认识生物学进程和疾病发生机制[3,4]。转录组学（transcriptomics)是功能基因组学（FunctionalGenomics)研究的重要组成部分，是一门在整体水平上研究细胞中所有基因转录及转录调控规律的学科[5,6]。随着人类基因组计划HGP(HumanGenomeProject)的完成，科学家也逐渐认识到对基因结构序列的研究仅仅是基因组学研究的一部分，并不能揭示所有的生命奥秘，所以接下来需要解决的问题是：研究这些基因序列的功能、参与的生命过程、表达调控方式，以及这些基因在不同的时空条件下的表达差异等。这些问题都需要功能基因组学技术来解决，而转录组学技术是功能基因组学研究的重要组成部分。对基因及其转录表达产物功能研究的功能基因组学，将为疾病控制和新药开发、作物和畜禽品种的改良提供新思路，为人类解决健康问题、食物问题、能源问题和环境问题提供新方法。2转录组学研究的方法在早期，由于测序价格昂贵、基因序列数目有限，转录组学研究者只能进行极少数特定基因的结构功能分析和表达研究。最近十几年，分子生物学技术的快速发展使高通量分析成为可能，这为真正意义上的转录组学的研究奠定了基础。这些高通量研究方法主要可以分为两类：一类是基于杂交的方法，主要是指微阵列技术（Microarray）；一类是基于测序的方法，这类方法包括表达序列标签技术（ExpressionSequenceTagsTechnology，EST）、基因表达系列分析技术（Serialanalysisofgeneexpression，SAGE）、大规模平行测序技术（Massivelyparallelsignaturesequencing，MPSS）、RNA测序技术（RNAsequencing，RNA-seq）。其中，Microarray和EST技术是较早发展起来的先驱技术，SAGE、MPSS和RNA-seq是高通量测序条件下的转录组学研究方法转录组学研究有助于了解特定生命过程中相关基因的整体表达情况，进而从转录水平初步揭示该生命过程的代谢网络及其调控机理。2.1微阵列技术（Microarry）微阵列技术是分子生物学领域具有里程碑式意义的重大突破，它可以同时测量不同样本中成千上万...参考学习个基因在不同环境和不同状态下的表达水平。基因表达数据是基于DNA微阵列技术而产生的反映基因转录产物mRNA丰度值的一组数据。数据中蕴含着丰富的基因活动信息，通过对这些数据中所隐含的基因活动信息进行分析，就可以解答一些生物学领域的问题。如基因的表达在不同环境中有哪些差异，基因的表达在特定条件下有哪些变化，基因之间有哪些相关性，以及在不同条件下基因的活动受到哪些影响等等[7]。2.1.1原理和方法DNA微阵列基本制作原理为大规模集成电路所控制的机器人在尼龙膜或硅片固相支持物表面，有规律地合成成千上万个代表不同基因的寡核苷酸“探针”，或液相合成探针后由阵列器(arrayer)或机器人点样于固相支持物表面。这些“探针”可与用放射标记物32P或荧光物如荧光素、丽丝胺等标记的目的材中的DNA或cDNA互补核酸序列相结合，通过放射自显影或激光共聚焦显微镜扫描后，对杂交结果进行计算机软件处理分析，获得杂交信号的强度及分布模式图,以此反映目的材料中有关基因表达强弱的表达谱。该技术仍以基因连锁、连锁不平衡、限制性长度多态性、可变串联重复序列及单核苷酸多态性标记等基因定位方法为基础，采用分子杂交等多种技术方法为手段，进行遗传作图,对不同材料中的多个基因表达模式进行平行对比分析，是一种高产出的、新的基因分析方法。以尼龙膜为固相支持物的DNA微阵列和以硅片为固相支持物的DNA芯片，二者在原理上相同,仅在支持物及检测手段等方面略有不同。在微阵列里最大的一类DNAmicroarray根据探针分子的构成又可以分为cDNA微阵列和寡核苷酸微阵列。（1）cDNA微阵列cDNA微阵列是指对各种生物随机克隆和随机测序所得的cDNA片段进行归类，并把每一类cDNA片段的代表克隆(代表一个独立基因)经过体外扩增，得到大小和序列不同的片段分别经过纯化后，利用机械手高速将它们高密度有序地点样固定在玻片硅晶片或尼龙膜上，从而制备成cDNA微阵列，以此对各基因的表达情况进行同步分析。它的特点是造价低、适用面广、研制周期短、灵活性高。而缺点是点阵密度相对比较低。同时，cDNA微阵列由于基因长短不一，导致溶解温度Tm各异，众多的基因在同一张芯片上杂交，使得杂交条件很难同一，这样也使得其分辨能力受到限制。（2）寡核苷酸微阵列寡核苷酸微阵列的主要原理与cDNA微阵列类似，主要是通过碱基互补配对原则进行杂交，来检测对应片断是否存在、存在量的多少。它与cDNA芯片的本质差别在于寡核苷酸的探针片断相对较短(一般是20-70nt的寡聚核苷酸序列)。寡聚核苷酸微阵列的探针经过优化，长度基本一致，并且Tm也相差不大，所以相比较cDNA微阵列它具有以下优点：1.无需扩增，防止扩增失败影响实验；2.减少非特异性杂交，能够有效的区分同源序列的基因；3.杂交温度均一，提高了杂交效率；4.减少了微阵列片上探...参考学习针的二级结构。上述特点使得寡核苷酸微阵列的应用日益广泛。但是当寡核苷酸序列较短时，单一的序列不足以代表整个基因，所以又需要用多段序列，从而提高了制作成本。2.1.2应用（1）表达差异的研究1995年Schena等用了48个PCR扩增的cDNA探针点制的微阵列片分析了野生型和转基因的拟南芥中基因表达差异，并与Northernblot作了比较。发现Microarray能够很好的检测到基因表达水平上的差异，并且能够在同一张玻片上使用不同的荧光染料同步进行差异比较。近年来，研究多集中于突变型与野生型、环境胁迫与正常生长型、激素处理与未处理或者不同组织器官之间的比较。Ma等[8]利用寡核苷酸微阵列研究了玉米3个雄性不育突变体和可育植株花药4个发育阶段的基因表达情况，检测到了近9200个正反义转录本。通过比较每个突变体与其可育花药的基因表达差异，筛选到了一大批可能与花药分化相关的重要转录因子和调控因子。Schena等[9]用人外周血淋巴细胞的cDNA文库构建一个代表1046个基因的cDNA微阵列，来检测体外培养的T细胞对热休克反应后不同基因表达的差异。发现有5个基因在处理后存在非常明显的高表达，11个基因中度表达增加和6个基因表达明显抑制。（2）寻找可能致病基因或疾病相关基因Moch等利用肿瘤微阵列芯片(5184个cDNA片段)发现了肾细胞癌的肿瘤标志物基因，并与正常细胞进行比较。在532份标本中检测到与胞浆纤维表达有关的一类基因阳性率为51%-61%，命名为vimentin。追踪观察，有Vimentin表达的患者，预后极差。Moch等利用肿瘤微阵列芯片(5184个cDNA片段)发现了肾细胞癌的肿瘤标志物基因，并与正常细胞进行比较。在532份标本中检测到与胞浆纤维表达有关的一类基因阳性率为51%-61%，命名为vimentin。（3）基因点突变及多态性检测现用于治疗AIDS的药物主要是病毒逆转录酶RT和蛋白酶PRO的抑制剂，但在用药3~12月后常出现耐药，其原因是rt、pro基因产生一个或多个点突变，rt基因四个常见突变位点是Asp67→Asn、Lys70→Arg、Thr215→Phe/Tyr和Lys219→Gln，四个位点均突变较单一位点突变后对药物的耐受能力成百倍增加[10]。如将这些基