方竹种质资源遗传多样性研究

1方竹和合江方竹种质遗传多样性研究刘跃钧1陈世通2王立平3傅兵4（1丽水市林业科学研究院，浙江丽水323000；2丽水九龙国家湿地公园管理处，浙江丽水323000；3遂昌县林业局，浙江遂昌323300；4丽水职业技术学院，浙江丽水323000）摘要：目的建立及优化方竹和合江方竹的ISSR-PCR反应体系，分析其12个种质资源的遗传多样性。方法采用L16（45）正交试验建立、优化ISSR-PCR反应体系，利用该体系分析12个不同种源的方竹和合江方竹的遗传多样性。结果最佳ISSR-PCR的最佳体系为：MgCl22.5mmol/L、dNTPs100μmol/L、Taq0.8U、引物0.1μmol/L、DNA20ng、1×ReactionBuffer。12个供试竹种被分为两大类群，其中除方竹遂昌种源2外的其他方竹竹种亲缘关系相当接近，归为一个亚群；合江方竹杭州种源和合江方竹莲都种源归到一个小亚群中。关键词：方竹；合江方竹；分子标记，遗传多样性；研究寒竹属（ChimonobambusaMakino）隶属于禾本科植物，其下有八月竹、大明山方竹、寒竹、毛环方竹、武夷山方竹、永善方竹、大叶方竹、合江方竹、云南方竹等20余种。我国拥有全部种类，其主要分布在秦岭以南各省区，比较集中的地区如四川、贵州等西南各省区。由于竹子是一类生物学特性特殊的植物，以地下鞭延伸为主的无性繁殖方式，以及开花时间、空间上的不确定造成有性繁育系统的缺乏，所以在亲缘关系鉴定，遗传图谱的建立等方面都存在着很大的困难。ISSR[1](intersamplesequencerepeat)分子标记由于不受环境及发育阶段的影响，其技术已经越来越多的应用到竹类植物起源、遗传多样性、分类、系统进化及构建遗传图谱等方面的研究。基金项目：丽水市重点科技合作项目（计划编号：20054012）作者简介：刘跃钧（1966-），男，浙江松阳人，教授级高工，从事野生植物开发利用研究。13967076656；[e-mail]表1寒竹属12种不同竹种采集地点种质代号种名种源种质采集地点1合江方竹丽水种源丽水市林科院百果园2合江方竹杭州种源浙江省林科院竹种园3方竹莲都种源1莲都区城西村4方竹莲都种源2莲都区大港头镇栋头村5方竹遂昌种源1遂昌县贵阳林场6方竹遂昌种源2遂昌县三仁乡林业站附近7方竹松阳种源1松阳县竹源乡小竹溪村8方竹松阳种源2松阳县三都乡9方竹松阳种源3松阳县竹源乡后畲村10方竹景宁种源景宁县东坑镇杨斜村11方竹庆元种源庆元林场场部12方竹杭州种源浙江省林科院竹种园2利用ISSR分子标记分析浙江省内合江方竹（C．hejiangensis）和方竹（C.quadrangularis）不同种源之间的的遗传多样性，为今后优良竹种的选育等提供理论依据。1材料与方法1.1材料及来源于2011年10月采集浙江省内寒竹属12种不同的种质资源（见表1）。其中10种采自丽水地区各县（市、区），2种采自浙江省林业科学研究院竹种园。采得的鲜嫩竹叶后，置于-80℃冰箱保存备用。1.2基因组DNA的提取用PlantDNAMiniKit试剂盒（OMEGA公司）抽提叶片组织的基因组DNA。利用琼脂糖胶电泳检测基因组DNA的大小及完整性，并用UV-2802S(上海洪富仪器仪表有限公司)测定基因组DNA的浓度和质量。1.3ISSR-PCR反应条件及程序影响PCR结果的因素主要为：引物、TaqDNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、Mg2+，借鉴杨本超[2]、王涛[3]的反应体系及参数，设计5因素4水平正交试验（表2）并利用正交实验进行适当优化。另外，前期的研究发现，反应体系中加入2%(v/v)去离子甲酰胺，1%(v/v)甘油，可提高PCR反应的特异性，同时使条带清晰。本研究的ISSR-PCR反应程序初步确认为：95℃预变性5min；然后95℃变性45s，50℃(退火温度随引物不同而变化)退火1min30s，72℃延伸1min30s，重复30个循环；最后为72℃延伸10min，4℃保存。表2ISSR-PCR正交设计表编号No．因素和水平FactorandlevelMgCl2(mmol/L)dNTPs(μmol/L)Taq/U引物(μmol/L)DNA/ng11.01000.20.11021.02000.40.22031.03000.60.33041.04000.80.44051.51000.40.34061.52000.20.43071.53000.80.12081.54000.60.21092.01000.60.420102.02000.80.3103112.03000.20.240122.04000.40.130132.51000.80.230142.52000.60.140152.53000.40.410162.54000.20.3201.4ISSR引物的筛选参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的第9套ISSR引物序列合成所用的ISSR引物，共60条（UBC821-880），引物由北京全式金生物技术有限公司合成。以浙江省林科院竹种园合江方竹基因组DNA为模板，进行引物筛选。1.5电泳及染色将筛选得到的引物分别以所有供试竹种基因组DNA为模板进行PCR反应。待反应结束后，进行3.5%聚丙烯酰胺凝胶（EB染色）电泳。用Dolphin-DOC+凝胶成像系统(Wealtec)进行分析，并记录数据。DNA标准分子量为MarkerIII(北京全式金生物技术有限公司)。1.6数据处理和统计方法用Dolphin-DOC+凝胶成像系统自带软件结合人工方法读带，ISSR扩增电泳图谱的每一条清晰且能重复出现的带，均为一个分子标记(marker)，代表一个引物结合位点。在相同的迁移位置上，有带用1表示，无带用0表示。采用NTSYS-pc2.10e分析软件计算样品间的遗传相似性系数，同时用UPGMA(unweightedpair-groupmethodanalysis)进行聚类分析，构建聚类图。2结果2.1正交试验按照清晰度、重复性及条带多少等遗传多样性的分析要求进行评分，最佳组合记16分，最差组合记1分。根据分数的不同求出每个因素水平下的平均值ki以及同一因素不同水平间的平均值的极差R。根据表4分析结果，可以得出各因素对寒竹属竹子ISSR-PCR反应影响大小顺序为：dNTPsTaqMgCl2引物DNA。正交试验的统计分析结果（表3）与电泳结果（图表3正交试验分析表编号MgCl2dNTPsTaq引物DNAk14.758.53.56.555k236.03.753.56k34.52.7545.54.5k47.151.758.253.753R4.156.254.753.0534图1正交试验电泳图1）对比显示，统计分析结果与第13组体系比较接近，在引物及DNA的用量上稍有差异。其中，DNA用量、引物浓度分别在20ng及0.1μmol/L时ki最高，反应水平最高。引物浓度与扩增产物的质量有一定的关系，引物过少扩增量不足，浓度过大引起非特异性扩增或产生引物二聚体，因此要选择适宜的引物浓度。DNA是PCR反应的模板，有较宽的浓度选择范围，其制约扩增产量及特异性，太少时无扩增谱带；浓度过高可能会造成非特异性扩增或弥散。最终确定寒竹属竹子ISSR-PCR的最佳体系为：MgCl22.5mmol/L、dNTPs100μmol/L、Taq0.8U、引物0.1μmol/L、DNA20ng、1×ReactionBuffer。2.2引物筛选本研究以省林科院竹种园合江方竹基因组DNA为模板，从60条ISSR引物中筛选出5条引物（表4）。它们能扩增出清晰的条带，并且稳定性和多态性都较好。这5条有效的ISSR引物在12份寒竹属竹种中共扩增出79条DNA带，条带大小为100-3000bp，具体扩增结果见表5。引物UBC855扩增出的清晰条带最多，为18条；引物UBC854的扩增条带数最少，仅有12条。其中引物UBC868扩增条带的多态性比率最高，为100%。总体上，5个有效引物共产生47条多态性带，平均多态性比率为59.4%，说明这些ISSR标记在寒竹属竹种基因组中能揭示较多的信息量。5个引物都能用来建立不同竹种的指纹图谱，其中引表4引物编号及其序列Y=(C或T)R=(A或T)引物编号PrimerCode引物序列SequenceofPrimersUBC835UBC843UBC854UBC855UBC868A(GA)7GYTC(TC)7TRCT(CT)7CRGA(CA)7CYT(GAA)65物UBC868的区分效果最好。2.3寒竹属竹种之间的遗传相似性分析用NTSYS-pc2.10e统计软件计算各样品间的Jaccard遗传相似性系数，结果见表6。12个寒竹属种质资源遗传相似性系数分布于0.2353-1.000之间。表55个有效ISSR引物的扩增结果引物编号Primercode扩增带数/条Totalamplifiedbands/band多态性条带/条Numberofpolymorphicbands/band多态性比率/%Percentageofpolymorphicbands/%UBC835UBC843UBC854UBC855UBC868总数Total平均Average17151218177915.87661117479.441.240.05061.1100292.359.4表612个寒竹属竹种的Jaccard相似性系数种质代号31271094112581631.0000120.88241.000070.88241.00001.0000100.88241.00001.00001.000090.94120.82350.82350.82351.000040.88240.76470.76470.76470.94121.0000110.88240.76470.76470.76470.94121.00001.000020.52940.41180.41180.41180.58820.64710.64711.000050.94120.82350.82350.82351.00000.94120.94120.58821.000080.94120.82350.82350.82351.00000.94120.94120.58821.00001.000010.35290.23530.23530.23530.29410.35290.35290.58820.29410.29411.000060.47060.35290.35290.35290.41180.35290.35290.58820.41180.41180.52941.00002.4寒竹属竹种之间的聚类分析在基于Jaccard遗传相似系数的UPGMA聚类图(图2)中，我们把12个供试竹种分为两大类群：合江方竹丽水种源，合江方竹杭州种源，方竹松阳种源1聚成一个类群，其余9个竹种聚成另一个大类群。合江方竹杭州种源和合江方竹莲都种源虽归到一个小亚群中，但相似性系数不是很高，只有0.5582。6图212个寒竹属竹种的UPGMA聚类图3讨论研究结果表明，除方竹遂昌种源2外的其他方竹竹种亲缘关系相当接近，相似性系数介于0.7647-1.0000之间，其中方竹松阳种源2、3，方竹遂昌种源1，为同一竹种；方竹莲都种源2和方竹庆元种源为同一竹种；方竹杭州种源、方竹景宁种源和方竹松阳种源1为同一竹种。可以认为，相同的几种方竹竹种可能引至一样的原产地。至于方竹遂昌竹种2具体为何竹种，有待通过形态学、分子生物学等手段做进一步考证。合江方竹杭州种源和合江方竹莲都种源虽归到一个小亚群中，但相似性系数只有0.5582，可能是受环境因素影响或者引种混乱所致，同样需要做进一步的研究。虽然ISSR分子标记技术在寒竹属竹种亲缘关系鉴定上的运用目前未见报道，但其他分子标记技术在竹类植物的研究上有较多应用。Watanabe[4-5]等以及Kobayashi先后利用RAPD分子标记技术研究了世界和亚洲竹类植物的系统分类和进化关系;Gielis等[6]利用RAPD分子