应用不同物理加强条件的Ⅰ型胶原支架的大白鼠动物模型与组织学分析

中国组织工程研究第20卷第12期2016–03–18出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchMarch18,2016Vol.20,No.12ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH1745·研究原著·张聪，女，1985年生，吉林省松原市乾安县人，汉族，2012年甘肃农业大学毕业，硕士，主要从事胶原材料制作及应用方面的研究。通讯作者：许和平，博士，教授，北京银河巴马生物技术股份有限公司，北京市101111；美国哈佛医学院，波士顿02138中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)12-01745-08稿件接受：2016-01-07应用不同物理加强条件的Ⅰ型胶原支架的大白鼠动物模型与组织学分析张聪1，张艳勤1，MarkSpilker1，3，MyronSpector2，李登云1，鲁玉梅1，许和平1，2(1北京银河巴马生物技术股份有限公司，北京市101111；2美国哈佛医学院，美国波士顿02138；3美国骨骼肌肉移植基金会，美国02101)引用本文：张聪，张艳勤，MarkSpilker，MyronSpector，李登云，鲁玉梅，许和平.应用不同物理加强条件的Ⅰ型胶原支架的大白鼠动物模型与组织学分析[J].中国组织工程研究，2016，20(12):1745-1752.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.12.011ORCID:0000-0003-1551-8550(许和平)文章快速阅读：文题释义：交联加强反应：不经任何交联加强的胶原在体内极易被胶原酶降解吸收。对于自体胶原以外的胶原物质不经交联其在机体内的组织反应较强。为了提高其抗降解能力、减少异物/免疫反应，提高物质的某些理化性能，需采用物理或化学方法对其进行交联加强。去除或替代肽链结构中某些离子或基团，使肽链中蛋白分子间形成暂时或永久性的联结，使其胶原纤维中蛋白分子在体内抗胶原酶降解性能以及对α-平滑肌收缩蛋白的抗收缩能力得到改善与提高。胶原：是哺乳动物体内含量最多的蛋白质(占体内蛋白质总量的25%-30%)，它是细胞外间质的主要成分，是形成细胞生长外环境的重要物质。而Ⅰ型胶原是体内诸多胶原种类中的一种，是绝大多数组织细胞生存所需要的物质，占体内胶原总量的90%，如皮肤，骨，肌腱，周围神经，脑膜，血管等。摘要背景：为改善胶原支架的降解性能，作者对胶原支架的高温脱水物理交联方法进行了改进，将交联时间由24h增加到48h，将交联温度由105℃提高到115℃。目的：验证改进高温脱水物理交联方法制备胶原支架的抗降解能力，获取支架在体内对受损组织修复与再生的最佳功效。方法：将高纯度保持三螺旋结构的动物源性Ⅰ型胶原制成膜状支架，分别采取3种不同条件的高温脱水进行交联加强(105℃/24h、105℃/48h、115℃/24h)，将1cm×1cm的材料置入大白鼠背部皮下组织，在置入后第3，14，42天处死，取出标本进行组织学检查与分析。结果与结论：实验表明，3组内置物在机体内均未发现严重的异物及特异性免疫机能性反应，采用105℃/48h加强条件处理的胶原支架，置入后14d在体内的存留及保持孔隙开放程度均较其他两组好(P0.05)，间接表明将交联加强时间从常规24h延至48h可以增强胶原支架在体内的抗降解性能。关键词：生物材料；材料相容性；胶原；支架；高温脱水；交联；降解；组织再生主题词：胶原；支架；组织工程胶原支架动物皮下置入生物相容性实验验证采用不同条件的高温脱水物理交联方法对胶原支架的抗降解能力的变化将高纯度保持三螺旋结构的动物源性Ⅰ型胶原制成膜状支架105℃/24h高温脱水进行交联加强105℃/48h高温脱水进行交联加强115℃/24h高温脱水进行交联加强置入大白鼠背部皮下组织置入后第3，14，42天，取出标本进行组织学检查与分析张聪，等.应用不同物理加强条件的Ⅰ型胶原支架的大白鼠动物模型与组织学分析P.O.Box10002,Shenyang110180:XuHe-ping,M.D.,Professor,BJYHBiomaxBiologicTechnologiesCo.,Beijing101111,China;HarvardMedicalSchool,Boston02138,USAHistologicalevaluationoftypeIcollagenscaffoldsprepardeunderdifferentdehydrothermalcross-linkingconditionsinaratmodelZhangCong1,ZhangYan-qin1,MarkSpilker1,3,MyronSpector2,LiDeng-yun1,LuYu-mei1,XuHe-ping1,2(1BJYHBiomaxBiologicTechnologiesCo.,Beijing101111,China;2HarvardMedicalSchool,Boston02138,USA;3MTF,USA)AbstractBACKGROUND:Inpreviousstudies,thedehydrothermalcross-linkingmethodwasmodifiedbytheauthorstoimprovethedegradationpropertyofcollagenscaffolds.Thecross-linkingtimewasincreasedfrom24to48hours,andthecross-linkingtemperatureincreasedfrom105to115℃.OBJECTIVE:Toverifytheanti-degradationabilityofcollagenscaffoldspreparedusingthemodifieddehydrothermalcross-linkingmethodandtoobtaintheoptimalefficacyofthescaffoldsondamagedtissuerepairandregeneration.METHODS:Highly-purifiedtypeIcollagenscaffoldswithnativetriplehelixstructurewerepreparedandsubjectedtothreedifferentdehydrothermalcross-linkingconditions:105℃for24hours,105℃for48hoursand115℃for24hours.Materialsamples,1cm×1cm,wereimplantedsubcutaneouslyintotheratdorsum.Thespecimenswereharvestedat3days,14daysand42postoperativedaysfollowedbyfixationandhistologicalanalysisusinghematoxylin-eosinstaining.RESULTSANDCONCLUSION:Nountowardforeignbodyandimmunologicalreactionswereobservedinanygroups.Inthegroupof105℃for48hours,thescaffoldretentionanddegreeofporeopennesswerebetterthantheothertwogroupsat14daysafterscaffoldimplantation(P0.05).Thesefindingsindirectlysuggestthattheanti-degradationabilityofcollagenscaffoldscanbestrengthenedundercertaindehydrothermalcross-linkingconditions:thecross-linkingtimeisincreasedfrom24to48hours.Subjectheadings:Collagen;Stents;TissueEngineeringCitethisarticle:ZhangC,ZhangYQ,SpilkeM,SpectorM,LiDY,LuYM,XuHP.HistologicalevaluationoftypeIcollagenscaffoldsprepardeunderdifferentdehydrothermalcross-linkingconditionsinaratmodel.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(12):1745-1752.0引言Introduction组织工程学与再生医学是21世纪高速发展的一种新型学科，其利用良好的生物材料、不同种类的细胞及组织生长因子，在机体器官或组织病变受损部位进行修复、再生，这种高科技理念、技术与方法可以应用于医学的各个领域，是21世纪医学科学的重大发展。在组织工程与再生医学领域中，同时运用两至三种材料进行临床使用并取得药品检验机构的认可批准，到目前为止不多。组织工程学与再生医学3大因素中生物材料的选择与使用有着特殊的要求，单独运用适当的生物材料修复机体损伤组织也可以起到明显的效果。Ⅰ型胶原是人体内有着重要生理功能的细胞外间质，对组织器官的结构组成起着至关重要的作用。由牛跟腱中提取的高纯度保持三螺旋结构的Ⅰ型胶原是一种天然生物组织材料，有着良好的组织相容性，经加工制作的胶原支架，在神经外科、骨科中已被广泛使用。天然的未经交联加强的Ⅰ型胶原支架在体内极易被特异性胶原酶分解代谢，而不能很好地发挥细胞外间质的支架作用，使受损部位细胞和某些未分化前质细胞不能充分利用支架所提供的空间与时间得以移行、分化、再生与重塑，导致受损组织与器官得不到良好的修复与再生[1]。采用某些物理化学方法去除或替代肽链结构中某些离子或基团，在肽链中蛋白分子间形成永久或暂时性的交联，使其胶原纤维中蛋白分子在体内抗胶原酶降解性能及对α-平滑肌收缩蛋白的抗收缩能力得到改善与提高，延长支架在体内的存留和保持孔隙开放状态[2]，从而使体内受损部位的健康组织细胞及未分化前质细胞有充足的时间在支架内修复再生，进而生成正常的组织细胞而再分泌自身细胞外间质，促进新生细胞的分化与生长，最终形成具有正常功能的组织与器官[3-6]。高温脱水交联加强是一种有效的物理加强方法，肽链中蛋白分子中水分子游离基(H+)的转换形成肽键间的交联结合，结果显示：经高温脱水处理后的胶原螺旋结构盘绕转变温度增强，在保持三螺旋结构的情况下提高了胶原的热稳定性，同时增强了胶原支架的抗降解能力[7-8]。Ⅰ型胶原产品的常规高温脱水加强条件通常为105℃/24h。在以往的研究中，将Ⅰ型胶原加定量的硫酸软骨素制成胶原支架，经常规高温脱水交联加强后置入大白鼠皮下组织，支架降解时间为7-10d[9-10]。作张聪，等.应用不同物理加强条件的Ⅰ型胶原支架的大白鼠动物模型与组织学分析ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH1747者设计了采用单一成分的高纯度保持三螺旋结构的Ⅰ型胶原支架并对其进行延时(从24h延长至48h)和升温(从105℃提升为115℃)交联加强实验，以观察其在体内抗降解性能的变化。通过不同条件下交联加强的胶原支架动物皮下置入生物相容性实验，观察改变加强条件后支架在机体内的变化，以期达到提高支架在体内抗胶原酶降解及抗α-