微生物基因表达调控.

主讲：陈晗DNA复制RNA转录蛋白质翻译基因表达机体如何控制遗传信息的传递过程以及规律转录转录翻译DNARNAmRNAProtein基因表达基因激活转录起始转录后加工及降解蛋白质降解翻译后加工修饰和降解多级水平上的调控一、基因表达的多级调控基因表达调控主要表现在以下方面：（1）转录水平上的调控（2）转录后的调控①mRNA加工成熟水平上的调控②翻译水平上的调控•原核生物中，营养状况和环境因素对基因表达起着举足轻重的影响。在真核生物尤其是高等真核生物中，激素水平和发育阶段是基因表达调控的最主要手段，营养和环境因素的影响力大为下降。二、操纵元operon1.定义原核生物细胞中，由操纵区同一个或几个结构基因联合起来，形成一个在结构上、功能上协同作用的整体称操纵元(或称操纵子)。2.1结构基因：指导酶和蛋白质表达产物合成。2.2操纵基因：负责结构基因“开”和“关”。无表达产物，又称操作子，DNA分子上阻遏蛋白的结合位点，用以阻止相邻启动子上转录的起始。2.3启动基因：即启动子，结合RNA聚合酶和启动转录。2.4调节基因：负责调节物质如阻遏蛋白的合成。2.组成三、诱导物和辅阻遏物•效应物：能够结合于蛋白质上并改变其性质的小分子物质称为～。•诱导物：与阻遏物或激活物结合后可启动操纵子转录的效应物称为该操纵子的～。•辅阻遏物：使阻遏蛋白具有活性或使活性蛋白失去活性的效应物称～。四、正调控与负调控•原核基因表达的正或负调控系统是按照没有调节蛋白存在的情况下，操纵元对于新加入的调节蛋白的反应情况来定义的。•1.正调控(positivecontrol)是指没有调节蛋白存在时，基因是关闭的，当加入调节蛋白分子后，基因活性开启，能进行转录。如激活物对操纵子的作用为正调控。因为激活物的活性状态能够开启它所控制的操纵子基因的转录。•2.负调控(negativecontrol)在无调节蛋白时基因表达具有转录活性，一旦加入调节蛋白，则基因活性被关闭，转录受到抑制，这种是负调控。负调控系统中的调节蛋白称作阻遏蛋白(或阻遏物)。负调控正调控LacOAraO诱导失活的阻遏物活化的激活蛋白阻遏物诱导物失活的活性蛋白诱导物阻遏诱导阻遏诱导TrpO阻遏失活的活性蛋白辅-阻遏物活化的激活蛋白辅-阻遏物失活的活性蛋白诱导阻遏诱导阻遏图16-1原核生物结构基因的4种表达调控类型(仿B.Lewin:《GENES》Ⅵ,1997,Fig.12.21)第一节乳糖操纵元•大肠杆菌可以利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖等作为碳源而生长繁殖。•细菌二次生长一、操纵元的组成乳糖操纵元（Lactoseoperon）包括lacZ、lacY、lacA三个结构基因，一个操纵基因O，一个启动基因P和一个调节基因I。•1.结构基因群：操纵元中被调控的编码蛋白质的基因可称为结构基因。乳糖操纵元含有z、y和a三个结构基因。•1.1lacZ基因：基因长3510bp，编码含1170个氨基酸、分子量为135，000的多肽，以四聚体形式组成有活性的β-半乳糖苷酶，催化乳糖转变为别(异)乳糖，和半乳糖和葡萄糖。1.2lacY基因：基因长780bp，编码由260个氨基酸组成，分子量30000的半乳糖透过酶（半乳糖透性酶），促使环境中的乳糖进入细菌；1.3lacA基因：基因长825bp，编码含275氨基酸，分子量为32000的转乙酰基酶，以二聚体活性形式催化半乳糖的乙酰化，形成乙酰半乳糖（在对乳糖的利用并非必需）。2.启动基因P：LacP为RNA聚合酶的结合位点，即启动子。3.操纵基因O：位于启动基因下游，可与阻遏物结合，形成转录的强抑制物。4.调节基因I：位于LacP的上游，可以产生阻遏蛋白。乳糖操纵子的结构操纵子P：启动序列O：操纵序列I：调节序列IPOCAP调控区ZYA结构基因转录起始点DNA解链区－50－40－30－20－101102030RNA聚合酶结合的起动子区阻遏物结合的操纵基因区图16-4在lac操纵子上阻遏物结合区和RNA聚合酶结合区的重叠二、阻遏蛋白的负调控1.当环境中没有乳糖时，1ac操纵子处于阻遏状态。调节基因I在其自身的启动基因P控制下，低水平、组成性表达产生阻遏蛋白，每个细胞中仅维持约10个分子的阻遏蛋白。•阻遏蛋白以四聚体形式与操纵基因O结合，阻碍了RNA聚合酶与启动子1acP的结合，阻止了基因的转录启动，β－半乳糖苷酶不能大量合成。•注意：阻遏蛋白的阻遏作用不是绝对的，阻遏蛋白与O偶尔解离，使细胞中还有极低水平的β－半乳糖苷酶及透过酶的生成。ZYAIPOCAP阻遏蛋白的负性调节•2.当环境有乳糖存在时，乳糖在透性酶的作用下进入细菌细胞，与阻遏蛋白结合，改变其三维构象，调节蛋白四聚体解聚成单体，失去与操纵基因的亲和力，操纵基因区没有被阻遏物占据，这时，RNA聚合酶便与启动子结合。所以启动子能够顺利起始mRNA的合成。•注意乳糖进入细胞后由半乳糖苷酶催化变为别乳糖，别乳糖是真正的诱导物。诱导物ZYAIPOCAPZYAIPOCAP乳糖操纵元属于可诱导操纵元，这类操纵元通常是关闭的，当受效应物作用后诱导开放转录。这类操纵元使细菌能适应环境的变化，最有效地利用环境能提供的能源底物。如果培养基中同时含有葡萄糖和乳糖，细菌只利用葡萄糖而不利用乳糖。需要说明阻遏蛋白对于lacO的结合并非经久不变，而是有10－20分钟的半衰期。虽然lacO处于游离状态的时间极短，但有时RNA聚合酶抓住这一时机进行一次转录。平均每个细胞周期有一个lacmRNA以此种方式产生，从而翻译出几个半乳糖苷酶、透性酶和转乙酰酶。即总有几个透性酶在值班，一旦培养基中有β－半乳糖苷类物质，就能允许他们进入细胞作为诱导物，这就是最初的诱导物为何能进入细胞的原因。未诱导：结构基因被阻遏阻遏物四聚体LacIPOlacZlacYlacA图16-当无诱导物时阻遏物结合在操纵基因上诱导：基因被打开β-半乳糖苷酶透性酶乙酰转移酶图16-7诱导物和阻遏物成为调节操纵子的开关四、乳糖操纵子的正调控1.激活蛋白（CAP）•代谢降解物基因激活蛋白简称CAP或cAMP受体蛋白或CRP。•CAP是二聚体蛋白质，它对转录没有直接的影响,只有cAMP与它结合才起作用，与阻遏蛋白的阻遏作用相反，起激活作用。结合后它就获得与DNA专一部位结合的能力,可增加邻近操纵子的转录速度。•在1ac操纵元的启动子1acP上游端有一段与lacP部分重叠的序列，能与CAP特异结合，称为CAP结合位点。CAP与该序列结合时，可增强RNA聚合酶的转录活性，使转录提高50倍。CAP结合位点•CAP以两种方法来激活转录：（1）它可能直接和RNAPol相互作用；（2）作用于DNA，改变其结构，从而帮助RNAPol结合。CAPPOTTTACA-35区TATGTT-10区CAP位点5′-ATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGG-3′R基因2.环式AMP葡萄糖对乳糖操纵子转录的阻断作用并不是直接的,其未知降解产物可以降低细胞内的环式AMP(cAMP)的含量起作用。此关键代谢物(cAMP)对葡萄糖降解代谢所抑制的各种操纵子的转录都是需要的,葡萄糖降解物控制细胞内cAMP水平的方式还不清楚。•ATP是cAMP的直接代谢前体,担任这种转化的酶是腺苷酸环化酶，此酶可能受代谢降解物的直接抑制。3.cAMP的正调控细菌中cAMP含量与葡萄糖分解代谢有关：•当环境中无葡萄糖可供利用时，cAMP含量就升高，CAP通过CAP结合位点与cAMP结合并发生空间构象的变化而活化，以二聚体的方式与特定的DNA序列结合，促进转录的进行。•当细菌利用葡萄糖分解供给能量时，cAMP生成少而分解多，cAMP含量低；cAMP浓度降低，CAP不能被活化，1ac操纵元的结构基因表达下降。-35-100CAPcAMPORNA聚合酶结合[无葡萄糖:有葡萄糖:cAMPcAMP(促进转录)(不促进转录)葡萄糖ATP减少cAMPATP活化的CAP失活的CAPATP转录不转录图16-17图16-17通过减少cAMP的水平葡萄糖导致了分解代谢的阻遏乳糖操纵元正性调节IPOZYACAPsiteCAPcAMPIPOZYACAPsite高乳糖、低葡萄糖诱导物IPOZYA阻遏蛋白高葡萄糖、低乳糖CAP低乳糖、低葡萄糖IPOZYAsitecAMPCAPIPOZYA高葡萄糖、高乳糖CAP注意※当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用；※如无CAP存在，即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合，操纵元仍无转录活性。※单纯乳糖存在时，细菌利用乳糖作碳源；※若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时,细菌首先利用葡萄糖。※葡萄糖对lac操纵元的阻遏作用称分解代谢阻遏。第二节色氨酸操纵元•色氨酸是构成蛋白质的组分，一般环境难以提供足够的色氨酸，细菌要生存繁殖常要自己合成色氨酸，但一旦环境能提供色氨酸时，细菌就充分利用外界的色氨酸、减少或停止合成色氨酸，以减轻自己负担。细菌所以能做到这点是因为有色氨酸操纵元的调控。•Lac\ara\gal均为分解代谢，而trp负责物质的合成，它不受葡萄糖或cAMP-CAP的调控。一、色氨酸操纵元组成trpE、trpD、trpC、trpB、trpA分支酸→邻氨基苯甲酸→磷酸核糖基→CDRP→吲哚甘油-磷酸→色氨酸邻氨基苯甲酸邻氨基苯甲酸合成酶吲哚甘油色氨酸合成酶硼酸合成酶β链α链60，00060，00045，00050，00029，000POlatrpEtrpDPtrpCtrpBtrpAtt’156016201353119180436P：起动子；O：操纵子；l：前导序列；a：衰减子；t,t’：终止子图16-15E.colitrpO的结构及其产物所催化的色氨酸合成反应结构基因二、负调控过程•色氨酸操纵元结构基因受两种方式的调控①阻遏蛋白的负调控（粗调控）；②mRNA转录的衰减子调控（细调控）•1.当色氨酸浓度低时，色氨酸不能与阻遏蛋白R结合，trp操纵基因不被占据，trpmRNA的合成可以进行，5个结构基因才开始转录成mRNA。（链接）•2.当环境能提供足够浓度的色氨酸时，R与色氨酸结合后构象变化而活化，就能够与操纵基因特异性结合，阻遏结构基因的转录。因此这是属于一种负性调控的、可阻遏的操纵元。（链接）P0I色氨酸水平低时IP0色氨酸水平高时trpRtrpPtrpOtrpEtrpDtrpCtrpBtrpA蛋白TrpR(无活性)活化的阻遏蛋白阻遏物(Trp)图16-27TrpR被Trp激活后可阻遏trp操纵子的转录(仿B.Lewin:《GENES》Ⅳ，1990,Fig.13.16)TrpTrp高时Trp低时mRNAOPtrpR调节区结构基因RNA聚合酶RNA聚合酶色氨酸操纵子三、衰减调控（弱化调节）•1.衰减子又称弱化子，位于mRNA分子前导序列中一段控制蛋白质合成速率的调节区，也是发生衰减（弱化）作用的转录终止信号序列。•前导序列：在trpmRNA5ˊ端trpE基因的起始密码前有一长162bp的mRNA片段的前导区。研究发现，mRNA合成起始以后，如培养基中有色氨酸，转录总是在这个区域终止，产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子，终止trp基因转录。色氨酸操纵子mRNA前导区核苷酸序列Trp操纵子前导序列中4个互补区段转录衰减衰减子前导区色氨酸操纵子P0I结构基因2.前导区结构•色氨酸操纵子的前导序列含4个序列互补区，能够形成不同的碱基配对的RNA结构。这四个序列分别称为1区、2区、3区、4区，其中1和2，2和3，3和4均可形成发夹结构（茎环结构），但2和3形成发夹结构后，1和2，3和4的发夹结构便不能形成。•3和4配对形成典型的不依赖ρ因子终止信号。衰减子(转录终止的调节)：提前终止转录，调节基因表达的功能区域。转录起始点前，存在前导序列：162nt（核苷酸）。P0前导区trp1234UUUU2334UUUU……UUUU……调节区结构基因trpROP前导序列衰减子区域UUUU……前导mRNA1234衰减子结构第10、11密码子为trp密码子终止密码子14aa前导肽编码区:包含序列1形成发夹结构能力强弱：序列1/2序列2