微生物实验

《脓汁和粪便标本中病原菌的检测》专业：11级临床检验学号：3110032011姓名：林楚娟小组成员：陈晓勇、林莉、廖家琪、林楚娟指导老师：何肖龙一．实验目的：（1）从脓汁和粪便标本中分离培养和检测出病原菌（2）熟悉培养基的制备、消毒和灭菌，细菌的分离和培养，细菌群体和个体形态特征的观察，细菌生化反应鉴定，细菌血清学反应鉴定，细菌药物敏感性试验等操作。二．实验器材：接种针、接种环、油性笔、打火机、试管架、普通冰箱、冷藏室、隔水式电热恒温培养基、奥林巴斯CX21型生物显微镜、1500W电炉、石棉网、蒸馏水、玻片缸、消毒液、锥形瓶、量筒、试管筐、糖发酵管、灭菌平皿、试管、刻度试管、洗耳球、硫酸纸、牛皮纸、尺子、橡皮筋、称量纸、天平、吸水纸、拭镜纸、细菌干粉培养基、斜面培养基、浓汁标本1支、粪便标本1支、碘酒棉球1瓶、酒精棉球1瓶、眼科镊子2把、伊红美兰平板2个、营养琼脂平板5个。三．实验方法与步骤（一）培养基的制备、消毒和灭菌干粉培养基→蒸馏水→加热溶化→分装→集中放在试管筐里，然后罩上硫酸纸、牛皮纸，用橡皮筋扎好→放入讲台边的灭菌桶或灭菌筐内→送到高压蒸汽灭菌室→灭菌（二）细菌的分离和培养1.采用平板划线分离法，取脓汁和粪便标本中混杂的多种细菌，分别在普通平板和伊红美蓝固体培养基表面划线，使之分散成单个菌落，在37摄氏度培养18—24个小时，从而分离出单个菌落。2.细菌群体生长特征的观察。观察形成菌落的大小、形状、边缘、表面、色素。3.细菌的纯培养。脓汁标本在普通平板上有黄色、白色两种菌落；粪便标本在伊红美蓝平板上，有紫黑色、淡粉红色两种菌落。挑选这四种不同的菌落在分别在斜面培养基接种，标记，在37摄氏度培养18个小时。（三）细菌个体形态的观察1.取两块玻片，在每块玻片上加生理盐水3—4ul，2滴，在一块玻片上取黄色和紫黑色菌苔少许（1mm小菌落的半量），与盐水混匀；在另一块玻片上取白色和粉红色的菌苔少许（1mm小菌落的半量）与盐水混匀。经在空气中干燥后，再用酒精灯将其固定住。2.革兰染色。用结晶紫对以上两块玻片进行初染1分钟，水洗；再用卢戈碘液媒染1分钟，水洗；然后用95%的乙醇对其脱色约20秒，水洗；最后用稀释复红复染1分钟，水洗；吸干，在显微镜下观察。（四）细菌的生化反应鉴定1.糖发酵实验：用接种针分别挑少许紫黑和粉红色的细菌接种到葡萄糖发酵管和乳糖发酵管中，在37摄氏度下，培养24小时，观察其产酸产气情况。2.半固体接种法：接种针斜面取四种不同的细菌，各自接种到四个半固体培养基，从半固体培养基中间垂直插入，再循着原来的路线退出接种环。在37摄氏度下，培养24小时，观察结果。（五）细菌血清学反应鉴定1.血浆凝固酶试验：取二滴兔血浆置于洁净的玻片上。分别用接种环取白色和黄色菌苔(约2～3个菌落的菌量)与血浆研磨混合成直径8～10mm的一层薄菌膜，立即观察结果。菌液出现明显凝块者为阳性，否则为阴性。来回侧倾载玻片，让菌液流动起来，结果更明显。2.玻片凝集试验：取洁净的载玻片两张，将磨面近端设为对照区，滴加生理盐水15ul。远端设为试验区，加福氏志贺菌诊断血清15ul，用接种环分别取粉红色菌苔和黑紫色菌苔，约2个小菌落的菌量，分别研磨于盐水或血清内，混合均匀。载玻片来回倾侧，让菌液充分混匀，观察结果。（六）细菌药物敏感性试验接种环分别取四种菌液3-6ul，两环，各自在四个平板上，做平板密集划线接种细菌。设计三点（等边三角形的三个顶点），做标记：青、链、庆。镊子火焰消毒，夹取相应的药物纸片，平贴在已设定的位置上，按压，最后镊子火焰灭菌。37摄氏度培养18-24小时，观察结果。四．实验现象及结论1.脓汁和粪便中的细菌在两种培养基上的菌落特点脓汁标本在普通平板上有黄色、白色两种菌落，菌落的色素是脂溶性的，是细菌本身的颜色。菌落直径2mm左右、圆形、隆起、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明。粪便标本在伊红美蓝平板上，有紫黑色、淡粉红色两种菌落，紫黑色细菌具有金属光泽、大而隆起、不透明，菌落直径2～3mm。淡粉红色细菌，半透明，直径1～2mm。2.经革兰氏染色后在显微镜下的形态特征玻片一：在显微镜下，黄色的细菌呈球形，呈葡萄串状排列，紫色，说明为革兰氏阳性菌；紫色的细菌呈杆菌，粉红色，说明为革兰阴性菌；玻片二：在显微镜下，白色细菌呈球形，呈链状排列，紫色，说明为革兰阳性菌；粉红色细菌呈短杆状，粉红色，说明为革兰阴性菌。2.糖发酵的实验结果（1）紫黑色细菌在葡萄糖和乳糖发酵管中都变色和产生气泡，说明紫黑色细菌能分解葡萄糖和乳糖，产酸产气。（2）粉红色细菌在葡萄糖发酵管中变色但不产生气泡，在乳糖发酵管中不变色不产生气泡。说明粉红色细菌能分解葡萄糖，产酸不产气，不能分解乳糖，不产酸不产气。4.药敏实验结果（1）黄色细菌和白色细菌均在青霉素、链霉素和庆大霉素纸片上出现抑菌圈，其中在青霉素的抑菌圈的直径分别为29mm、32mm，说明两者均对青霉素敏感；在链霉素的抑菌圈的直径分别为12mm、13mm，说明两者均对链霉素中度敏感；在庆大霉素的抑菌圈的直径分别为16mm、17mm，说明两者均对庆大霉素敏感。（2）紫黑色细菌和粉红色细菌在青霉素均不出现抑菌圈，说明两者均对青霉素耐药；在链霉素的抑菌圈的直径分别为15mm、16mm，说明两者均对链霉素敏感；在庆大霉素的抑菌圈的直径分别为17mm、18mm，说明两者均对庆大霉素敏感。5.血浆凝固酶的实验结果黄色菌落的细菌能使血浆产生颗粒性物质，说明其为凝固酶阳性，是致病菌；白色菌落的细菌不产生凝集反应，说明其为凝固酶阴性，不是致病菌。6.半固体培养基中的实验结果紫黑色细菌在半固体培养基中呈扩散生长，培养基浑浊，说明紫黑色细菌有鞭毛；粉红色细菌在半固体培养基中沿接种线生长，说明粉红色细菌没有鞭毛。7.血清玻片凝集反应的实验结果紫黑色的细菌不能使福氏志贺菌诊断血清产生凝集反应，说明其不是福氏志贺菌；粉红色细菌能使福氏志贺菌诊断血清产生颗粒性物质，即发生了凝集反应，说明其是福氏志贺菌。五．实验结论总结：1.从浓汁标本中分离出黄色和白色两种菌落。显微镜下，这两株细菌均为G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌；结合菌落或菌苔颜色，这两株葡萄球菌分别是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。通过血浆凝固酶试验鉴别，金黄色葡萄球菌是致病菌。2.用伊红美蓝平板，从粪便标本中分离出紫黑色具有金属光泽和粉红色半透明菌落。紫黑色菌落是能分解乳糖的大肠埃希菌。粉红色菌落是不能分解乳糖的致病菌。显微镜下，它们都是G-杆菌，散在排列，从形态上不能鉴别是什么细菌。经糖发酵试验，半固体动力试验，血清学试验结果鉴定，它们分别是大肠埃希菌和福氏志贺菌。六．实验讨论：1..实验的第一步是依据检验目的菌的不同选择不同的培养基抑制杂菌以提高检出病原菌的检出率，可见了解各种细菌的适宜生长环境对病原菌的检出有很大的影响，分离培养的细菌菌落可根据菌落的颜色，表面的光滑与否做出初步的判断并采取下一步适合的操作。2.用革兰染色法对细菌进行染色的时候，在染色过程中对时间的控制很重要，尤其在酒精脱色的时间把握更为严格，脱色过久过短都会影响实验结果。3.菌落挑错了、不是单菌落、无菌操作不严格、污染杂菌、接种时未协调好、接种错误等都可能导致实验结果错误。4.必须用纯的细菌培养物作鉴定。因为不同的细菌生化反应结果相差较大，而反应结果是以阳性或阴性表示的，一旦用混合菌做生化反应，结果不可分析。5.鉴定试验的选择：测定细菌的实验方法很多，根据鉴定目的选择适当的试验项目，既能完成鉴定，项目又尽可能少。一般考虑以下几个问题。（1）选择有价值的试验：鉴别两种细菌选择的试验应该其一为阳性，另一为阴性，且阳性和阴性的概率大于90%。否则，试验无鉴别价值。（2）选择快速简便的试验。因为是常规实验室，选择的方法应快速方便，如鞭毛染色、氧化酶、凝固酶等应为首选方法。鉴定一种细菌如果有几种特异方法,只选一两种,多选无价值。（3）测定细菌的一种生物特性可能有几种不同方法。应该了解所用方法的敏感性，否则会导致错误的鉴定。