微生物实验七放线菌的形态观察

实验七放线菌的形态观察13生物基地201300140059刘洋2014-11-23同组者：吕赞刘沛余马华峥一、实验器材1.菌种青色链霉菌、弗氏链霉菌3-5d高氏I号培养基平板培养物2.仪器和其他用品酒精灯，载玻片，盖玻片，载玻片夹子，镊子，显微镜，接种环，平皿，试管，烧杯，滴管，无菌水，酒精等3.培养基高氏I号培养基（配方见附录）二、实验目的1.学习并掌握放线菌的形态、观察方法——插片法。2.了解放线菌的基本形态。3.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。三、实验原理1．高氏I号培养基高氏I号培养基是用来培养和观察放线菌形态特征的合成培养基。此合成培养基的主要特点是含有多种化学成分已知的无机盐，这些无机盐可能相互作用而产生沉淀。因此，在混合培养基成分时，一般是按配方的顺序依次溶解各成分，甚至有时还需要将二种或多种成分分别灭菌，使用时再按比例混合。此外，合成培养基有的还要补加微量元素，如Fe元素。2．放线菌放线菌（actinomycetes）是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌。广泛存在于自然界中，土壤中最多，主要以孢子繁殖，至今发现的共有五六十属，它与人类的关系极为密切，根据1978年的统计，在当时已发现的5128种抗生素中，有3165种为各种放线菌所产生，链霉菌属又占放线菌中的首位（占放线菌产生的抗生素中的87.5％）；有的放线菌还可用于生产维生素、酶制剂等；少数会引起人类、动物、植物的疾病。链霉菌属是放线菌中种类最多、分布最广、形态特征最典型的类群，其孢子丝的形态多样，而且性状较稳定，是对它们进行分类、鉴定的重要指示。因此学习如何培养和观察它们不仅对科学研究有很大的意义，对实际生活应用也有很大的帮助。本实验采用合成培养基进行培养，采用插片法取菌观察，不仅可观察到放线菌自然生长状态下的特征，而且便于观察不同生长期的放线菌形态，除此之外还可以采用玻璃纸法、印片法进行观察。链霉菌属（Streptomyces）共约1，000多种，它们具有发育良好的菌丝体，也是实验中选取它们观察的重要原因。在显微镜下直接观察时，气丝在上层、基丝在下层，气丝色暗，基丝较透明。孢子丝依种类的不同，有直、波曲、各种螺旋形或轮生。在油镜下观察，放线菌的孢子有球形、椭圆、杆状或柱状。能否产生菌丝体及由菌丝体分化产生的各种形态特征是放线菌分类鉴定的重要依据。3．插片法观察放线菌将放线菌接种在琼脂平板上，扦上灭菌盖玻片后培养，使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻上。观察时，轻轻取出盖玻片，置于载玻片上直接镜检。这种方法可观察到放线菌自然生长状态下的特征，而且便于观察不同生长期的形态。4、放线菌的菌落特征干燥、不透明，表面呈紧密的丝绒状，上有一层色彩鲜艳的干粉；菌落与培养基的连接紧密，难以挑取。其孢子的表面结构、形状及颜色在一定条件下比较稳定，是鉴定菌种的重要依据。放线菌在自然界分布很广，绝大多数为腐生，少数寄生。四、实验步骤1.配制高氏I号培养基（200mL）：1)按配方先称取可溶性溶粉、放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉尽量溶解，再加入沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶解。2)称取其他各成分依次溶解。由于条件限制，对于微量成分FeSO4·7H2O，直接用分析天平称量，加入即可。3)待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积，进行pH调节到7.2～7.4。4)材料灭菌：将所配溶液装在三角烧瓶中并加棉塞，棉塞外包一层牛皮纸，并用麻绳捆好，用记号笔标记组号。取十个培养基，用牛皮纸包好，用记号笔标记大小面。同理盖玻片也用牛皮纸包好，再在盖玻片上加盖一层牛皮纸纸，用牛皮纸包好后，用记号笔标记，镊子也包好一起灭菌。将上述物品放入密封的加压灭菌锅中进行高压蒸汽灭菌121℃、20分钟。2.倒平板：取融化并冷却高氏I号培养基倒平板，倒平板时尽量使培养基厚一些，凝固待用。3.接种：按照无菌操作的要求用接种针挑取菌种培养物在平板上密集划线接种。4.插片：以无菌操作用酒精泡过并在酒精灯上灼烧的镊子将灭菌的盖玻片以大约与培养基成45°角插入平板内，并与划线垂直，每个平板插入3个盖玻片。5.培养：将平板倒置，28℃培养7d。6.镜检：用酒精泡过并在酒精灯上灼烧的镊子小心拔出盖玻片，擦去一面培养物，然后将有菌的一面朝下放在载玻片上，直接用低倍镜和高倍镜镜检，必要时可用油镜观察。五、注意事项在插片法操作过程中，注意在移动附着有菌体的盖玻片时勿碰动菌丝体，必须菌体朝上，以免破坏菌丝体形态。如果用0.1%美蓝对培养后的盖玻片进行染色后观察，效果会更好。六、实验结果各种菌丝形态特征菌种基内菌丝形态气生菌丝形态孢子丝形态青色链霉菌较长，疏松，多分枝毛状紧密螺旋形弗氏链霉菌略短，较密，多分枝厚絮状直条状青色链霉菌弗氏链霉菌直线状孢子丝螺旋形孢子丝七、思考题1.镜检时如何区分放线菌基内菌丝、气生菌丝及孢子丝？答：气生菌丝直生或分枝丝状，较基内菌丝粗，是指从基质伸向空气中的菌丝体。菌类的菌丝体多是匍匐在基质上，或是贯通基质而伸长的，为了孢子的形成而生长气生菌丝。在一定条件下，水生菌类也可以生长气生菌丝。真菌和放线菌的营养菌丝发育到一定时期，长出培养基外并伸向空间的菌丝称为气生菌丝。它叠生于营养菌丝上，以致可以覆盖整个菌落表面。在光学显微镜下，颜色较深，直径比营养菌丝粗，直形或弯曲，有的产生色素。在固体培养基上霉菌的菌丝分化为营养菌丝和气生菌丝。营养菌丝深入到培养基内吸收养料；气生菌丝向空中生长，有些气生菌丝发育到一定阶段分化成繁殖菌丝，产生孢子。2.弗氏链霉菌和青色链霉菌的孢子丝有何区别?答：青色链霉菌的孢子丝为螺旋形，而弗氏链霉菌的孢子丝为直线形。八、附录高氏I号培养基可溶性淀粉20gKNO31gNaCl0.5gK2HPO40.5gMgSO40.5gFeSO40.01g琼脂20g水1000mLpH自然