微生物检验第五章G+球菌.

第十四章革兰阳性球菌第一节葡萄球菌属•在自然界广泛分布。•存在于人和动物的皮肤黏膜上的菌株•可致多种化脓性感染–疖、痈、脓肿、菌血症等–烫伤样皮肤综合症–毒性休克综合症二、临床意义致病物质：酶血浆凝固酶耐热核酸酶毒素葡萄球菌溶素杀白细胞素肠毒素表皮剥脱毒素毒性休克综合征毒素金黄色葡萄球菌所致疾病感染类型所致疾病侵袭性局部感染：疖、痈、毛囊炎、伤口化脓、内脏器官感染全身感染：败血症、脓毒血症毒素性假膜性肠炎、食物中毒凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）所致疾病1、CoNS是人体皮肤黏膜正常菌群之一，是医院感染的主要病原菌。2、表皮葡萄球菌：人工瓣膜性心内膜炎、静脉导管感染、腹膜透析性腹膜炎、血管移植物感染和人工关节感染等。3、腐生葡萄球菌：女性尿路感染的重要病原菌。1.菌体形态：球形，葡萄串状，无鞭毛，无芽胞，体外培养无荚膜。革兰染色阳性球菌。2.培养特性：兼性厌氧，易培养，在普通平板、血平板上生长良好。大部分菌落产生有色素：金黄色、白色、柠檬色。有些菌溶血，产生透明的β溶血环。三、生物学特性3.生化反应和抗原构造•触酶阳性•多数菌分解葡萄糖、麦芽糖和蔗糖，产酸不产气。4.抵抗力•对外界因素的抵抗力强于其他无芽胞菌。•干燥脓汁、痰液中可存活2~3个月。•耐盐性强，能在10%~15%NaCl培养基中生长。•易产生耐药性，对青霉素G的耐药性已达90%以上，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA已经成为医院内感染最常见的致病菌。•病原性葡萄球菌一般分布在人的皮肤和鼻咽部，带菌率达20%~50%，医务人员带菌率达70%，是医院内交叉感染的重要传染源。（一）标本采集•根据感染的部位，采集不同的标本。•该属细菌广泛分布在人体皮肤和黏膜，采取时避免病灶周围正常菌群污染。四、微生物检验（二）检验程序（三）标本直接检查•无菌体液如脑脊液和穿刺液可直接涂片、革兰染色后直接显微镜检查，查见细菌具有重要临床价值。•其他体液标本如同时伴有炎性细胞时则直接显微镜检查结果也具有参考价值。•涂片检查发现有形态相似的革兰阳性球菌，则可初步报告“查见类似葡萄球菌属革兰阳性球菌”，并进一步进行分离和鉴定予以证实。（四）分离培养与鉴定脓液、分泌物等接种于血琼脂平板有污染的标本如粪便等应接种在选择平板上，如甘露醇高盐平板、哥伦比亚多粘菌素奈啶酸平板血液标本则用肉汤增菌培养基1.菌落与菌体形态金黄色葡萄球菌直径6~8mn，金黄色或橙色，菌落周围出现或不出现透明溶血环表皮葡萄球菌直径为5~6mm，某些产粘液菌株能粘附在琼脂平板表面，无色或白色溶血葡萄球菌直径5~9mm，不透明，无色素或奶油色、黄色里昂葡萄球菌直径4~7mm，边缘整齐稍扁，奶色、黄色和沃氏葡萄球菌相似腐生葡萄球菌直径5~8mm，白色或柠檬色注意：菌落外观疑为葡萄球菌者应进行革兰染色证实，甘露醇高盐平板上金黄色葡萄球菌菌落为黄色。2．凝固酶试验玻片法-测定结合型凝固酶试管法-测定分泌型凝固酶金黄色葡萄球菌、中间型葡萄球菌呈现阳性反应3．耐热核酸酶试验•大多数金黄色葡萄球菌、施氏葡萄球菌、中间葡萄球菌、猪葡萄球菌能产生耐热核酸酶。•表皮葡萄球菌、模仿葡萄球菌、肉葡萄球菌含微弱耐热核酸酶。4．磷酸酶试验•大多数的表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌、施氏葡萄球菌、中间葡萄球菌和猪葡萄球菌为阳性。•将待测菌种点种在加有硝基酚磷酸盐的pH5.6~6.8MH琼脂上，孵育18~24h，菌落周围出现黄色为阳性。定义：凡对甲氧西林、苯唑西林、头孢西丁耐药，或PBP2a阳性、mecA基因阳性的葡萄球菌定义为耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）。耐甲氧西林葡萄球菌*耐甲氧西林葡萄球菌（MRSA、MRSE）的含义：1.对所有β-内酰胺类(青霉素类，头孢菌素类，碳青霉烯类)抗生素耐药。2.对绝大多数的大环内酯类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类、四环素类、磺胺类也耐药。3.万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺敏感。第二节链球菌属（Streptococcus）传统分类Lancefield抗原血清分型种系分类法溶血现象丙型（γ）链球菌甲型（α）溶血性链球菌乙型（β）溶血性链球菌血清群与溶血特性没有相关性遗传学和血清学分型不能统一一、分类不溶血D群链球菌：牛链球菌α溶血性链球菌β溶血性链球菌肺炎链球菌草绿色链球菌A、C、G群B群：无乳链球菌化脓、马、似马链球菌米勒链球菌二、临床意义酶：链激酶、链道酶、透明质酸酶脂磷壁酸化脓性链球菌肺炎链球菌致病物质所致疾病毒素：链球菌溶素O和S、红疹毒素M蛋白致病物质：荚膜、溶血素、神经氨酸酶所致疾病：大叶性肺炎、支气管炎、中耳炎、乳突炎、鼻窦炎、脑膜炎和菌血症。超敏反应性疾病：急性肾小球肾炎、风湿热化脓性感染中毒性疾病：猩红热无乳链球菌引起新生儿菌血症和脑膜炎米勒链球菌在手术和创伤时引起内源性感染草绿色链球菌可引起心脏瓣膜异常患者的亚急性细菌性心内膜炎猩红热(scarletfever)由产生致热外毒素的化脓性链球菌所致。细菌经咽喉粘膜侵入机体，增殖并产生毒素引起高热、全身红疹等症状，病后获得较强的免疫力。链球菌是直径小于2μm的球形或卵圆形革兰阳性球菌，呈链状排列，链的长短和细菌的种类及生长环境有关。1.形态染色三、微生物学特性肺炎链球菌呈矛尖状，宽端相对尖端向外，成双排列，无芽胞、无动力，但能形成荚膜和粘液层。•兼性厌氧菌•营养要求高•血平板α、β、γ三种特征性溶血现象•肺炎链球菌–荚膜多糖使菌落呈粘液状–产生自溶酶，培养48h后出现“脐窝状”菌落。2．培养特性3．生化特性和抗原构造•发酵葡萄糖和多种糖，不产气，乳酸为代谢终末产物，触酶阴性分20个群M抗原荚膜蛋白质多糖肽聚糖细胞膜细胞质近年对青霉素耐药甚至多重耐药的肺炎链球菌的出现并在全球播散，引起高度关注。4.抵抗力大多数细菌对干燥和消毒剂敏感；较少引起细菌耐药性。（二）标本采集•咽拭子、痰液、脓汁和血液等标本采集后在2h内运送到实验室，立即进行检查和接种。•对B群溶血链球菌的检查，用无菌棉签采集第35周~37周妊娠妇女的阴道分泌物，置于含多粘菌素(10μg/ml)和萘啶酸(15μg/ml)选择性培养肉汤中孵育18~24h，再作分离培养。（三）标本直接检查•直接显微镜检查–标本涂片、革兰染色、显微镜检查见链状排列革兰阳性球菌有助于无正常菌群污染标本的诊断–荚膜肿胀试验用于检查肺炎链球菌•直接检测抗原–咽拭标本的A群链球菌和女性生殖道标本的B群链球菌可用抗原检测荚膜肿胀试验（四）分离培养与鉴定•用羊血琼脂平板培养初代分离需用5%CO2环境，35~37℃孵育24h。•观察菌落性状：溶血现象及菌落大小。•革兰染色为革兰阳性球菌，链状或短链状排列，触酶试验阴性，6.5%NaCl不生长者可确定为链球菌属细菌。(1)Lancefield群特异性抗原鉴定：B群为无乳链球菌，F群为米勒链球菌。(2)PYR试验：化脓性链球菌阳性(3)杆菌肽敏感试验：化脓性链球菌阳性。(4)VP试验：挑取平板上孵育过夜菌落置于2mlVP肉汤中，孵育6h后加入VP试剂，摇匀30秒，出现桃红色者为阳性。（5）CAMP试验β-溶血链球菌鉴定链球菌属内的鉴定试验非β溶血链球菌鉴定菌种optochin敏感试验胆汁溶菌试验胆汁七叶苷试验肺炎链球菌S+—草绿色链球菌R——牛链球菌R—+抗链球菌溶素O抗体检测•常用于风湿热的辅助诊断。•活动性风湿热患者抗体效价一般超过400单位。标本分离培养脓汁，血液，咽喉拭子直接涂片镜检革兰阳性链球菌与葡萄球菌菌的鉴别H2O2阳性1.肚脐样菌落2.荚膜肿胀试验3.胆汁溶菌试验溶血环与肺炎链球菌的鉴别αLancefeild、PYR、杆菌肽敏感试验、CAMP试验βH2O2阴性6.5%NaCl不生长者第三节肠球菌属•广泛分布在自然界。•常栖居在人、动物的肠道和女性生殖道。•为医院感染的重要病原菌。一、分类•肠球菌属原归类于链球菌属。•于1984年将其命名为肠球菌属。•至今，经由16SrRNA序列分析和核酸杂交等，证实肠球菌可分为5群19个种。•临床标本分离的肠球菌多属于第2群。二、临床意义•肠球菌所致感染最多见于泌尿道感染,是重要的医院感染病原菌。–多与泌尿道器械操作、留置导尿、尿路结构异常有关。–腹腔和盆腔创伤时也是常见的感染菌。–肠球菌引起的菌血症常发生于有严重基础疾患的老年人、长期住院接受抗菌药物治疗的免疫功能低下患者。•近年来不断上升的肠球菌感染率和广泛使用抗菌药物出现的耐药性有关。•在临床诊断前应认真评估分离菌的临床意义。•临床标本中分离的80%~90%是粪肠球菌。•屎肠球菌约占5%~10%。•很少分离到肠球菌属的其它种。•肠球菌为革兰阳性球菌、呈单个，成对或短链状排列，琼脂平板上生长的细菌呈球杆状。•液体培养基中呈卵圆形、链状排列。•无芽胞和荚膜，个别菌种有稀疏鞭毛。1.形态2.培养特性•兼性厌氧，最适生长温度35℃，10℃和45℃均能生长。•营养要求不高。•所有菌株在含6.5%NaCl肉汤中能生长。•在40%胆汁培养基中能分解七叶苷。3.生化反应和抗原构造•多数菌种具有吡咯烷酮芳基酰胺酶，能水解吡咯烷酮-β-萘基酰胺（PYR）。•不含细胞色素氧化酶和触酶。–但粪肠球菌培养于含血的培养基中，可合成细胞色素或触酶或两者皆有，因而某些菌株表现为触酶弱阳性。•含链球菌D群抗原。G+C为37~45mol%。4.抵抗力•对头孢菌素类、林可霉素类和磺胺类抗菌药物耐药。•近年来获得性耐药菌株不断增多，表现为对氨基糖苷类耐药和对万古霉素耐药。对万古霉素的耐药是由vanA、vanB和vanC等基因介导。（一）检验程序（二）标本采集•常规方法采集血、尿、创伤标本和其他拭子，标本于1小时内接种完毕。（三）标本直接检查•涂片染色显微镜检查可见单个、成双或短链排列卵圆形革兰阳性球菌。（四）分离培养与鉴定•标本接种于含血琼脂平板。•若送检标本中含革兰阴性杆菌可选用选择鉴别培养基，常用的有：–叠氮胆汁七叶苷琼脂，可抑制革兰阴性菌生长，而肠球菌分解七叶苷产生黑色菌落；–哥伦比亚多粘菌素-萘啶酸琼脂(CAN)和苯乙基乙醇琼脂(PEA)。•由于耐万古霉素肠球菌发生率增高，为早期检出耐药菌株，可使用含万古霉素琼脂筛选方法。鉴定方法•菌属的鉴定。•肠球菌属细菌革兰染色阳性，卵圆形，单个、成双或短链排列。•触酶阴性、胆汁七叶苷和PYR阳性、6.5%NaCl肉汤中能生长，45℃生长。肠球菌属间的菌种鉴定根据对甘露醇，山梨醇和精氨酸的代谢分五群–第一群:分解甘露醇、山梨糖产酸，不水解精氨酸–第二群:分解甘露醇和水解精氨酸–第三群:水解精氨酸，不分解甘露醇、山梨醇和山梨糖–第四群:不分解甘露醇，山梨糖，不水解精氨酸–第五群:分解甘露醇不分解山梨糖，不水解精氨酸