微生物检验第十一章厌氧菌

第二十三章厌氧菌Anaerobicbacteria学习要点•厌氧菌感染的条件、临床特征和微生物学检验•厌氧球菌、无芽孢厌氧杆菌的种类和临床意义•梭状芽孢杆菌的种类、致病机制和微生物学检验第一节概述•一大群在有氧条件下不能生长，必须在无氧或低氧条件下才能生长的细菌•有芽胞的G+梭菌，只有一个属，即梭菌属，共有130个种，以芽胞形式存于体外•无芽胞的G+及G-杆菌与球菌，包括40多个属，300多个菌种和亚种•厌氧菌的感染遍及临床各科，且多为混合感染；对氨基糖甙类抗生素耐药，而对甲硝唑(灭滴灵)普遍敏感厌氧菌无芽胞菌G+杆菌丙酸杆菌属双歧杆菌属乳杆菌属优杆菌属放线菌属G-杆菌类杆菌属普雷沃菌属卟啉单胞菌属梭杆菌属G+球菌消化球菌属消化链球菌属G-球菌韦荣球菌属有芽孢菌G+杆菌梭状芽孢杆菌属•正常情况下菌群之间保持着微生态平衡，厌氧菌代谢产生的乙酸、乳酸等能抑制病原菌生长•如长期使用广谱抗生素、激素、免疫抑制剂等，在发生菌群失调或机体免疫力下降或细菌进人非正常寄居部位时，这些厌氧菌即可作为条件致病菌而导致内源性感染•无芽胞厌氧菌在临床厌氧菌标本检出率中约占90％，分布广泛，多为条件致病菌•无芽胞厌氧菌同需氧菌与兼性厌氧菌共同构成机体的正常菌群，其中厌氧菌占有绝对优势，例如肠道菌群占99.9％两类厌氧菌感染的不同点──────────────────────────────项目有芽胞厌氧菌感染无芽胞厌氧菌感染──────────────────────────────感染类型外源性感染为主内源性感染为主致病因素以外毒素为主,内毒素侵袭因素为主,毒性强毒性弱感染中比例10%90%机体条件多数与健康与机体抵抗力关系不大降低密切相关各科分布多见于外伤感染、分布临床各科,引起食物中毒身体各部位炎症,脓肿,败血症临床病型具有特殊临床病型无特殊临床病型治疗以抗毒素治疗为主以抗菌药物治疗为主预防多数可用抗毒素紧急增强机体抵抗力预防,以类毒素预防──────────────────────────────厌氧菌感染的条件•组织缺氧或氧化还原电势(Eh)降低可造成厌氧菌生长的适宜环境，易于遭受厌氧菌感染•局部组织的氧化还原电势降低：如血管损伤、烧伤、动脉硬化、肿瘤压迫、组织坏死等，可造成局部组织的缺血、缺氧等•皮肤黏膜屏障被破坏：如大面积外伤伴有需氧菌感染，为厌氧菌感染提供了条件厌氧菌感染的条件•机体免疫功能下降：如接受免疫抑制剂、放疗或化疗的患者；糖尿病、慢性肝、肾疾病及老人、婴幼儿、早产儿等•菌群失调：长期应用氨基糖甙类抗生素，或长期应用头孢菌素、四环素等无效者，均可诱发厌氧菌感染•需氧菌、兼性厌氧菌的混合感染。需氧菌生长耗竭了氧气，有利于厌氧菌的生长厌氧菌感染的临床特征•感染局部产生气体，组织肿胀和坏死•粘膜附近的感染•深部外伤的继发感染，流产胃肠手术后发生的感染•分泌物有恶臭，或为暗血红色，并在紫外光下发出红色荧光•分泌物涂片镜检有细菌，而常规培养阴性者；或在培养基深部长的细菌•长期应用氨基糖甙类抗生素治疗无效病例第二节厌氧菌检验•标本采集•临床在进行厌氧菌培养前应与实验室联系，以便实验室做好接种培养的准备•不能被正常菌群污染；应尽量避免接触空气。最理想是能取得组织标本•下列标本无送检价值，不宜做厌氧菌培养：①鼻咽拭子；②齿龈拭子；③痰和气管抽取物；④胃和肠道内容物、肛拭；⑤接近皮肤和粘膜的分泌物；⑥褥疮溃疡及粘膜层表面；⑦排出的尿或导尿；⑧阴道或子宫拭子；⑨前列腺分泌物•标本运送中应尽量避免接触空气，不要冷藏•标本运送方法•1.无氧小瓶运送法•2.厌氧袋运送法•3.针筒运送法•4.其他运送法厌氧菌感染的微生物学检验•直接镜检•结合标本来源，性状与气味，可提供许多有用的信息,对估计标本中含菌量、细菌种类和选择培养基等都有意义•除血液外，各种标本均须直接涂片作革兰染色镜检，标本发臭，镜检发现细菌染色不均，形态奇特者常是厌氧菌的表现厌氧菌感染的微生物学检验•直接镜检•标本呈琥珀酸味，带血性或用紫外灯照射发红色荧光，涂片镜检为G-球杆菌，间或有长短不一的多形性，并有恶臭者，常为产黑色素普雷沃菌•菌体细长，两端尖,为梭形的G-杆菌，有紫色颗粒沿菌体长轴排列，成双排列尖端相对，并有丁酸臭味者，常是具核梭杆菌•菌体高度多形性，长短不一，菌体中部肿胀或呈圆球者，可能是坏死梭杆菌厌氧菌感染的微生物学检验•直接镜检•如两端钝圆着色深，中间着色浅不均匀，且有空泡，长短不一的革兰阴性杆菌常脆弱类杆菌•极小的G-球菌，可能是韦荣球菌•G+无芽胞杆菌，呈乳酸气味者，可能是乳酸杆菌；呈丙酸气味者，并有特殊排列呈X、Y、或栅状者可能是痤疮丙酸杆菌；有醋酸气味的可能是双歧杆菌•菌体分枝，呈棒状或栅状排列，且发现黄色颗粒，有琥珀酸气味者，多是放线菌厌氧菌感染的微生物学检验•直接镜检•G+芽胞杆菌，肯定是梭状芽胞杆菌属•G+短粗两端钝圆杆菌，无芽胞，中性粒细胞也很少且变形破碎，标本来自战伤或肢体严重肿胀者，大多是产气荚膜梭菌•G+杆菌，有芽胞，并有异丁酸或异戊酸等气味，标本来自抗生素相关性肠炎者，大多是艰难梭菌厌氧菌感染的微生物学检验•根据镜检结果选择合适的培养基，常用的有非选择性和选择性培养基两种•非选择培养基•强化血琼脂平板(BAP)：即布氏琼脂或牛心、牛脑浸出液琼脂为基础培养基，补加酵母浸膏（0.5％）、动物血（5％-10％）、维生素K1（0.1μg/ml）和氯化血红素(5μg/ml)，是一种非选择性培养基，几乎能培养出所有的厌氧菌厌氧菌感染的微生物学检验•选择培养基•卡那—万古霉素冻溶血琼脂平板（KVLB）：可抑制大多数兼性厌氧菌，使产黑色素普雷沃菌早期形成黑色素。只需2-3d出现黑色菌落。绝大多数类杆菌属、普雷沃菌属和紫单胞菌属都生长良好，梭杆菌和厌氧球菌不能生长。是常用的选择性培养基。卡那霉素含量为75-100μg/ml，万古霉素为75μg/ml厌氧菌感染的微生物学检验•培养基•七叶苷胆汁平板（BBE）：本培养基含20％胆汁，1g/l七叶苷和100μg/ml的庆大霉素。抑制需氧菌，胆汁抑制对之敏感的厌氧菌。只有耐胆汁的脆弱类杆菌与可变梭杆菌和死亡梭杆菌不被抑制，反被刺激菌落较大，还能水解七叶苷，菌落周围有棕黑色的晕厌氧菌感染的微生物学检验•选择培养基•卵黄平板（EYA）和兔血平板：用于选择产气荚膜梭菌，标本接种兔血平板，见有双溶血环，内环是与菌落一样大小的透明溶血，外环是宽的甲型溶血，放半小时后菌落变绿色或褐色，同时可接种卵黄平板，以进行卵磷脂酶试验鉴定产气荚膜梭菌•FS培养基梭杆菌选择培养基•VS培养基韦荣球菌选择培养基•CCFA培养基艰难梭菌选择培养基厌氧菌感染的微生物学检验•厌氧培养方法•厌氧罐培养法：应用物理或化学方法造成无氧环境。如冷触媒法：利用气体发生器产生氢及二氧化碳，产生的氢在触媒作用下，与罐内的氧结合成水，将氧消耗掉，造成无氧环境。产生的二氧化碳约为10％，也适宜厌氧菌生长。方法为：先将触媒(金属钯或铂)及美蓝指示剂放入罐内，然后将已接种的平板置于罐内，将气体发生袋的指定角剪开，加入10ml水，立即放入罐内，封闭厌氧罐即可厌氧菌感染的微生物学检验•厌氧培养方法•气袋法：原理相同，只是将厌氧罐用无毒、透明的塑料袋代替•厌氧手套箱培养法：厌氧手套箱公认的培养厌氧菌最佳仪器。它是密闭的大型金属箱，前面有透明面板，板上装两个手套，可通过手套在箱内进行操作。适用于在无氧环境中连续进行标本接种、培养和鉴定等全部工作•厌氧工作站厌氧菌感染的微生物学检验•鉴定试验：据厌氧菌的菌体形态、染色反应、菌落性状以及对某些抗生素的敏感性等作出初步鉴定。最后鉴定则要进行生化反应及终末代谢产物等项检查•形态与染色：不仅能反映各种厌氧菌的特殊形态，同时也为鉴定厌氧菌提供参考依据；可用拉丝实验协助判定染色结果厌氧菌感染的微生物学检验•菌落性状：不同厌氧菌其菌落形状和性质不同。梭菌的菌落特点是形状不规则，而无芽胞厌氧菌多呈单个的圆形小菌落•色素：产黑色素普鲁沃菌产生黑褐色或黑色色素。龋齿放线菌产生粉红色色素。奈氏放线菌产生黄褐色色素•溶血：产气荚膜梭菌在新鲜血琼脂平板形成双溶血圈•荧光：产黑色素普鲁沃菌在紫外线灯下，显示砖红色荧光；梭杆菌常发生黄绿色荧光；艰难梭菌发生绿色荧光厌氧菌感染的微生物学检验•快速鉴定：其原理是依据细菌在代谢过程中所产生的胞外酶与少量生化基质迅速反应，能在4小时观察结果，无需在厌氧环境下培养，只需用浓菌液即可，自动化程度高•其他•耐氧试验：当在厌氧平板上有菌生长时，为确定是否为厌氧菌，必须做耐氧试验•药物鉴定试验：用于鉴定厌氧菌的抗生素有卡那霉素和灭滴灵。卡那霉素的敏感性将梭杆菌属与类杆菌属区分开，大多数类杆菌对卡那霉素耐药；灭滴灵纸片在鉴别厌氧菌(敏感)与非厌氧菌(不敏感)有重要意义厌氧菌感染的微生物学检验•其他•聚茴香脑磺酸钠试验：厌氧消化链球菌对50g/l的聚茴香脑磺酸钠溶液敏感，而绝大多数其他G+球菌耐药•生化鉴定：主要包括多种糖类发酵试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验、触酶试验、卵磷脂酶试验、脂肪酶试验、蛋白溶解试验、明胶液化试验及胆汁肉汤生长试验和硫化氢试验等。为简化厌氧菌鉴定，有多种试验鉴定系统，如推测性平皿系统等。虽然不完善，但可使厌氧菌的鉴定标准化，自动化厌氧菌感染的微生物学检验•其他•气液相色谱技术（GLC）：应用GLC分析厌氧菌的终末代谢产物，因各种厌氧菌的代谢产物不同，故已成为鉴定厌氧菌及其分类的比较可靠的方法．可在数十分钟至数小时即可作出诊断•PCR：如采用PCR方法检测抗生素相关性腹泻病人粪便中艰难梭菌的毒素基因阳性率高达82．8％，明显高于厌氧培养法的检出率19.2％，且与厌氧培养法的一致性为100％厌氧菌感染的微生物学检验•其他•基因探针：如用地高辛标记脆弱类杆菌的基因探针，检测标本中的脆弱类杆菌其敏感性为89％，特异性为91．7％，检测灵敏度为10pgDNA，故其特异性强，敏感性和灵敏度均高，并具有快速简便的优点厌氧菌感染的微生物学检验•检验结果分析与报告•根据革兰染色镜检，菌落性状、耐氧试验及药敏试验若发现厌氧菌可初步报告：“检出厌氧菌，形似xxx菌”•再根据生化反应及终末代谢产物作最终报告：“分离鉴定出xxx菌”及“药物敏感试验：xxx结果”•有条件的单位可采用基因探针或PCR技术，快速准确的检测厌氧菌临床标本肉眼观察分离培养增菌培养及直接镜检厌氧培养2-7d确定厌养培养需氧培养厌氧培养生长无生长生长兼性厌氧菌专性厌氧菌保存菌种分类鉴定药物敏感试验形态与染色菌落特性生化反应药敏性鉴定气液相色谱第三节厌氧球菌（Anaerobiccocci）•在临床标本中检出的厌氧菌大约有25％为厌氧性球菌•G+消化球菌和消化链球菌属•G-韦荣球菌属临床意义•黑色消化球菌（P.niger）是消化球菌属中唯一的菌种•通常寄居在人的体表和与外界相通的腔道中，是人体正常菌群，在临床上可引起人体各部组织和器官的感染，常与其他细菌混合感染，如腹腔感染、肝脓肿等一、消化球菌属（Peptococcus）微生物学检验•G+，菌体圆形，直径0.3-1.3μm，单个、成双、短链或成堆排列，无芽胞，无荚膜微生物学检验•生长缓慢，厌氧培养2-4d才形成黑色不溶血的小菌落，接触空气后颜色变浅，传代后黑色消失，通过庖肉培养后又可产生黑色素•不发酵糖，触酶阳性为其特点。对青霉素、红霉素、氯霉素、洁霉素、四环素及灭滴灵敏感微生物学检验•标本黑色有臭味•从感染部位采集标本，作直接涂片镜检和分离培养。接种血琼脂平板，并同时接种含血清硫乙醇酸盐培养基或庖肉培养基(增菌培养)，经厌氧培养2-4d后，观察菌落形态，革兰染色观察菌体形态和排列作出初步报告。据生化反应、抗生素纸片敏感试验以及气液相色谱分析代谢产物作出最后报告二、消化链球菌属（Peptostreptococcus）•厌氧消化链球菌、不解糖消化链球菌、吲哚消化链球菌、大消化链球菌、微小消化链球菌、普氏消化链球菌、产生消化链球菌、四联消化链球菌与天芥菜春还原消化链球菌等•代表菌种为厌氧消化链球菌（P.anaerobi