微生物生理学.

第二章微生物细胞的结构和功能原核微生物真核微生物原核微生物与真核微生物的比较微生物家族成员微生物病毒、亚病毒（类病毒、拟病毒、朊病毒）古生菌（Archaea）真细菌（Eubacteria）真菌（酵母、霉菌等）、单细胞藻类、原生动物等非细胞型细胞型原核微生物真核微生物（Eukarya）细菌、放线菌、蓝细菌、衣原体、支原体、螺旋体、立克次氏体等微生物类型不同，细胞的结构和功能不同。（Prokarya）第一节原核微生物原核生物：无核膜，裸露DNA，单细胞包括真细菌（Eubactera）和古生菌（Archaea）两大类群。蓝细菌支原体立克次氏体衣原体细菌放线菌原核微生物古细菌细胞结构的研究方法细胞破碎的方法1、研磨法：最简便的方法，不需要特殊设备，缺点是破碎细胞的效率不高，丝状真菌常用此法。2、弹道法：效果好，价格便宜，易操作，平时用来打碎细胞。3、压榨法：原理是利用高压破碎细胞。French压榨机：压细胞悬液，对G-和G+杆菌效果好，对G+球菌和芽孢差。X-压榨机：压冰冻细胞，对G+和G-都有效，设备昂贵，操作麻烦。超声波细胞破碎仪4、超声波法：缺点是在处理过程中细胞不能同步破碎，有的先破，有的后破。注意不要在塑料容器内处理细胞悬液，因为塑料能吸收超声波能量。以上方法都属机械（物理）破碎，破碎效率大小为：X-压榨机＞振荡磨＞French压榨机＞超声波＞研磨微生物对破碎的抗性大小为：酵母菌＞丝状真菌＞G+球菌＞G+杆菌＞G－杆菌＞嗜盐菌＞支原体5、渗透冲击（osmoticshock）：高渗溶液、酶形成原生质体或球质体，方法温和，分离细胞器和酶时常采用此法，实际上是两步：酶溶壁后，低渗溶液对原生质体破坏。G+细胞壁成分是肽聚糖，用溶菌酶处理。G-制备成球质体，细胞壁成分复杂，肽聚糖外有脂多糖，可采用反复冰冻--融化或EDTA处理后再用溶菌酶溶壁。细菌取对数生长中期制备最合适。酵母菌和丝状真菌用蜗牛酶，但原生质体再生能力差。藻类用纤维素酶。放线菌细胞壁成分与G+相似，故也用溶菌酶。亚细胞结构的分离通常采用离心法，离心有差速离心和密度梯度离心方法。一般构造：一般细菌都有的构造特殊构造：部分细菌具有的或一般细菌在特殊环境下才有的构造一、细胞壁（Cellwall）绝大多数的原核细菌和真核的真菌和藻类的细胞都有细胞壁，形成细胞的骨架，失去它细胞变为球形。占细胞干重约10～20%。细胞壁是分类鉴定的一个重要指标，不同的微生物细胞壁结构和化学组成不同。细菌超薄切片电镜照片（示细胞壁与细胞膜）革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌细胞壁的构造1．革兰氏阳性细菌的细胞壁特点：细胞壁较厚，约（20～80nm），化学组分简单，一般只有肽聚糖（占90%）和磷壁酸（占10%）组成。G＋`G－细胞壁成分的区别成分肽聚糖磷壁酸类脂质蛋白质占细胞壁干重的%含量很高（30-95）含量较高（50）一般无（2）0含量很低（5-20）0含量较高（-20）含量较高G＋G－(1)肽聚糖(peptidoglycan)：肽聚糖是由多糖链经短肽相交联而形成的网络状分子，是真细菌细胞壁特有的成分，构成细菌细胞壁坚硬的骨架部分。短肽交联多糖链肽聚糖结构肽聚糖单体组成双糖单位四肽尾肽桥原核生物所特有的已糖青霉素作用点溶菌酶作用点N-乙酰葡糖胺N-乙酰胞壁酸革兰氏阳性菌肽聚糖的结构五肽交联桥五个甘氨酸四肽侧链L-丙、D-谷、L-赖、D-丙聚糖骨架G：N-乙酰葡萄胺M：N-乙酰胞壁酸四肽尾双糖单位由四个氨基酸分子按L型与D型交替方式连接而成双糖单位中的β-1,4-糖苷键很容易被溶菌酶(lysozyme)所水解,从而引起细菌因肽聚糖细胞壁的“散架”而死亡。肽聚糖结构肽桥D型氨基酸可保护肽聚糖免受肽酶的攻击表肽聚糖分子中的四种主要肽桥类型类型甲肽尾上连接点肽桥乙肽连接点例I第四氨基酸-CO.NH-直接相连第三氨基酸E.coli(G-)II第四氨基酸-(Gly)5第三氨基酸S.aureus(G+)III第四氨基酸-(肽尾)1~2-第三氨基酸M.luteus(G+)IV第四氨基酸-D-Lys-第二氨基酸C.poinsettiae(G+)注：IV型中第3个氨基酸不是二氨基酸，而是高丝氨酸，因此与D-Glu连接磷壁酸壁磷壁酸：膜磷壁酸（脂磷壁酸）：跨越肽聚糖层并与细胞膜相交联的称～。与肽聚糖分子进行共价结合的称～。细菌细胞结构（2）磷壁酸（teichoicacid）磷壁酸是结合在革兰氏阳性细菌细胞壁上的一种酸性多糖，是革兰氏阳性细菌所特有的成分之一。主要分为甘油磷酸或核糖醇磷酸。G+菌细胞壁特殊组分－磷壁酸Teichoicacids（3）壁醛酸某些G+在限量磷酸盐的培养基中不能合成磷壁酸而合成壁醛酸，由糖醛酸和氨基己糖交替连接形成酸性杂多糖，不含磷酸，但也是酸性。枯草芽孢杆菌的壁醛酸成分是：（葡萄糖醛酸-N-乙酰氨基半乳糖）n磷壁酸的主要生理功能：1、通过分子上大量的负电荷浓缩细胞周围的Mg2+，提高细胞膜上需Mg2+的合成酶的活性；2、贮藏磷元素；6、增强某些致病菌对宿主细胞的粘连、避免被白细胞吞噬以及抗补体的作用；5、革兰氏阳性细菌特异表面抗原的物质基础；4、噬菌体的特异性吸附受体；3、能调节细胞内自溶素(autolysin)的活力，防止细胞因自溶而死亡。可作为细菌分类、鉴定的依据细菌细胞结构2、革兰氏阴性细菌细胞壁结构特点：肽聚糖层很薄（仅2~3nm），在肽聚糖层外还有一个外膜，成分较复杂，整个壁厚度较G+菌薄，机械强度较G+菌弱。是G-细菌细胞壁所特有的结构，位于G-细菌细胞壁外层，由脂多糖、磷脂和脂蛋白等若干种蛋白质组成的膜，有时也称为外壁。（1）外膜(outermembrane)G-CellWallO-特异侧链脂蛋白脂多糖肽聚糖①脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）位于G-细胞壁最外层的一层较厚（8~10nm）的类脂多糖类物质。类脂A核心多糖(corepolysaccharide)O-特异侧链或称O-多糖或O-抗原（O-specificsidechain）脂多糖G-CellWall脂多糖LPS的结构与主要功能LPSO-特异侧链由4-5种单糖组成重复聚合体，具有抗原特异性，称O-抗原。糖的种类和排列因菌种而异，决定了G-细菌细胞表面抗原决定簇的多样性。如：沙门氏菌属(Salmonella)的抗原型多达2107种。这种多变性是革兰氏阴性细菌躲避宿主免疫系统攻击，保持感染成功的重要手段。G-CellWallLPS核心多糖主要由己糖、庚糖、辛糖酸、磷酸、乙醇胺组成，其中庚糖（Hep）和辛糖酸（KDO）是特有的糖类，核心多糖在不同细菌中糖的种类变化不大。Hep：L-甘油-D-甘露庚糖KDO：2-酮-3-脱氧辛糖酸LPS类脂A基本结构是二个氨基葡萄糖组成的二糖，糖羟基被磷酸和脂肪酸取代，脂肪酸有12C、14C、16C的，其中β-羟基肉豆蔻酸（14C）是特有的。类脂A是G-细菌致病物质——内毒素的物质基础。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)沙门氏菌属脂多糖中的类脂A结构ROR1、R2一般为3—羟基豆蔻酸CH2OROCH2PO4PO4NH|R1NH|R2OR1、6O—特异侧链核心多糖R可有3种：月桂酸基棕榈酸基豆蔻酰豆蔻酸基类脂A是G-内毒素的基础LPS类脂A：2个N-乙酰葡糖胺及5个长链脂肪酸核心多糖区O－特异侧链：多个4Hex单位，内含半乳糖、鼠李糖甘露糖、阿比可糖(Abq)等内核心区3个2－酮－3－脱氧辛糖酸3个L－甘油－甘露庚糖外核心区：5个己糖（Hex），包括葡糖胺、半乳糖、葡萄糖脂多糖（Lipolysaccharide)的组成Cncnc-microLPS的主要功能为：类脂A是革兰氏阴性细菌致病物质——内毒素的物质基础；因其负电荷较强，故与磷壁酸相似，也有吸附Mg2+、Ca2+等阳离子以提高其在细胞表面浓度的作用；对细胞膜结构起稳定作用。由于LPS结构的多变，决定了革兰氏阴性细菌细胞表面抗原决定簇的多样性，是许多噬菌体在细胞表面的吸附受体；具有控制某些物质进出细胞的部分选择性屏障功能。（2）外膜蛋白(outermembraneprotein)嵌合在LPS和磷脂层外膜上的蛋白。有20余种，但多数功能尚不清楚。研究较为清楚的有脂蛋白和孔蛋白。脂蛋白（lipoprotein）分子量约为7200，通过共价键使外膜层牢固地连接在肽聚糖内壁层上。孔蛋白（porins）是由三个相同分子量（36000）蛋白亚基组成的一种三聚体跨膜蛋白，中间有一直径约1nm的孔道，通过孔的开、闭，可对进入外膜层的物质进行选择。G-CellWall（3）肽聚糖含量较少，少数几层，占细胞干重的5-10%。G-细菌肽聚糖单体结构与G+细菌基本相同，差别仅在于：①四肽尾的第三个氨基酸分子是内消旋二氨基庚二酸(m-DAP)。（只在原核微生物细胞壁上发现）②没有特殊的肽桥，只形成较为疏稀、机械强度较差的肽聚糖网套。G-CellWallMGL-AlaD-GluDAPD-AlaMGL-AlaD-GluDAPD-AlaMGMGMGMGMGMGMGMGMGMGMGMGMGMGMGMGMGMGMGMGMGMGMGMGMMMMMMG-细菌肽聚糖结构（局部）又称壁膜间隙。G+和G-细菌中均有，一般指其细胞壁与细胞膜之间的狭窄空间（宽约12~15nm），呈胶状。（4）周质空间(periplasmicspace,periplasm)G-CellWall周质空间是进出细胞的物质的重要中转站和反应场所在周质空间中，存在着多种周质蛋白（periplasmicproteins）水解酶类合成酶类结合蛋白受体蛋白G-CellWall成分革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌革兰氏染色反应肽聚糖层磷壁酸外膜脂多糖类脂和脂蛋白质鞭毛结构产毒素产芽孢对干燥对机械的抗性对溶菌酶对青霉素和磺胺碱性染料的抑菌作用菌体呈紫色含量高，多层，紧密多数有,含量较高(50)无无低（仅抗酸性细菌含类脂）基体上着生2个环以外毒素为主有的产抗性强强敏感敏感强菌体呈红色含量低，1-2层，疏松无有有高基体上着生4个环以内毒素为主不产抗性弱弱不敏感不敏感弱表革兰氏阳性细菌与阴性细菌细胞壁成分的比较Left:单菌染色结果(G+或G-)Right:混合菌染色结果(G+和G-)细菌细胞结构革兰氏染色结果及细菌分类革兰氏染色阴性3．古细菌(Archaea）的细胞壁古细菌大多生活在极端环境中，包括甲烷菌、极端嗜盐菌、嗜热嗜酸菌，绝大多数都有细胞壁，但它的细胞壁不同于真细菌的细胞壁，不含肽聚糖，没有细菌胞壁酸和D-氨基酸特征。所以，所有古生菌都不受溶菌酶和β-内酰胺抗生素如青霉素的作用。细胞壁组成有两类：一类含假肽聚糖or杂多糖，另一类由蛋白质or糖蛋白的亚单位组成。注：古细菌中没有共同的细胞壁成分，而是为了适应极端的环境产生的不同细胞壁成分，如嗜盐杆菌含大量酸性氨基酸，可平衡环境中高浓度的Na+，可生活在高盐溶液中。图２-6甲烷杆菌细胞壁中假肽聚糖的结构（单体）不同菌种或菌系组成成分有变异交联古生菌细胞壁结构类型1）细胞壁的功能：（1）固定细胞外形和提高机械强度;（2）为细胞的生长、分裂和鞭毛运动所必需;（3）渗透屏障，阻拦酶蛋白和某些抗生素等大分子物质（分子量大于800）进入细胞，保护细胞免受溶菌酶、消化酶和青霉素等有害物质的损伤;（4）细菌特定的抗原性、致病性以及对抗生素和噬菌体的敏感性的物质基础;细菌细胞结构二、细胞质膜和间体1、细胞质膜结构细胞质膜（cytoplasmicmembrane）又称质膜（plasmamembrane）、细胞膜（cellmembrane）或内膜（innermembrane），是富有弹性的半透性薄膜，厚约7～8nm，约占细胞干重的10%，是十分重要的亚细胞结构，少了它细胞将死亡。分离：用平衡密度梯度离心法，可从破碎的原生质体悬液中分出膜碎片。主要成分是脂类和蛋白质，还有少量多糖。磷脂（占20%～35%）细胞膜蛋白质（占50%～65%）疏水的非极性端亲水的极性端脂类在不同类型的微生物中的种类和重量都不一样，原核生物主要脂类有磷脂、糖