微量淋巴细胞毒法检测HLA

微量淋巴细胞毒法检测HLA-B27试验的质量保证岳文勇（152医院检验科，河南平顶山467000）[关键词]微量淋巴细胞毒法HLA-B27试验质量保证国内外研究表明，强直性脊柱炎患者HLA-B27抗原阳性率为83%-95.19%[1,2]。对患者进行HLA-B27检测已经成为临床排除、提示或预防强直性脊柱炎的一个重要的辅助手段。目前,检测血清中HLA-B27的方法有微量淋巴细胞毒法、ELISA法、流式细胞仪法、PCR-SSP法等。相比而言，ELISA法特异性和敏感性较差;流式细胞仪和PCR-SSP两种方法试验要求高,均需价格昂贵仪器而普及受限;微量淋巴细胞毒法特异性好、操作无须特殊仪器,适合二级以下医院推广使用[4,5]。但由于试验条件难以控制、HLA高度多态性等因素，微量淋巴细胞毒法检测HLA-B27时容易出现误判漏判，因此临床检验工作者更应该加强微量淋巴细胞毒法检测HLA-B27试验时的质量保证意识。2003年-2007年,笔者临床应用微量淋巴细胞毒法检测HLA-B27共1886人份,总结出几点经验,供大家交流探讨。.微量淋巴细胞毒法检测HLA-B27试验原理简介:通过淋巴细胞分离液分离外周抗凝血中有活性的淋巴细胞,与检测板上已知的B27抗体反应,若待检淋巴细胞膜上有B27抗原存在,则在补体的参与下,在细胞膜上打孔,细胞死亡,加入染料透入后而着色。1实验材料的质量保证1.1淋巴细胞分离液与HLA-B27反应板1.1.1淋巴细胞分离液保存淋巴细胞分离液必须避光、无菌、4℃冷藏保存,保证分离液的成分不受破坏。笔者的经验是:根据平常工作所需要的量，一次性把250ml分离液无菌操作，分装在多个大玻璃试管中,随用随取，可以避免批次间交叉污染。1.1.2HLA-B27反应板选择HLA-B27反应板必须选择有质量保证和批准文号的合格试剂板，保证检测结果高度稳定性。1.2外周血抗凝剂选择抗凝剂EDTA-K2较肝素好。2003-2007年，笔者随机选择本院门诊疑似AS患者1006例，经患者同意后抽取5ml静脉血液，分为A、B两组，A组用肝素完全抗凝血液2.5ml，B组用EDTA-K2完全抗凝血液2.5ml。离心前，两组抗凝血液均作血涂片观察记录淋巴细胞形态，便于比较离心后两组淋巴细胞形态情况；两组均分离血浆，观察有无溶血，溶血的血液不选用。离心时，两组均使用同一天平配平，使用同一台离心机。离心后，两组均由同一人员规范操作，提取淋巴细胞。本研究就四个方面对两组进行比较，比较结果：EDTA-K2最大的优点是对细胞形态影响小，不会造成对死活细胞的误判，见表1。表1两组患者不同抗凝剂比较肝素组（n=1006）例数%EDTA-K2组（n=1006）例数%有淋巴细胞聚集现象414.07201.99有溶血现象30.2920.19有血小板碎片混入现象10210.1411211.1淋巴细胞形态有改变201.9920.192实验操作的质量保证2.1配平及离心淋巴细胞分离前，要用高精度天平配平后方可放入水平离心机中沉淀分离。因分离液分离淋巴细胞是利用细胞的密度不同进行密度梯度离心法进行分层的,配平不当而离心会导致细胞分层不明显，无法获得较高纯度的淋巴细胞。2.2淋巴细胞提取提取淋巴细胞时注意勿混入红细胞。大量的红细胞沾染，很难与小淋巴细胞鉴别，易致假阳性。笔者去除淋巴细胞中红细胞的经验是:先加一滴洁净蒸馏水于淋巴细胞中,快速混匀以便破坏红细胞,随后立即加入8-10ml的生理盐水颠倒混匀,保持淋巴细胞的等渗状态。然后低速离心沉淀.反复几次可去除彻底。2.3淋巴细胞洗涤洗涤淋巴细胞时要轻轻颠倒混匀,避免淋巴细胞剧烈振荡死亡,造成结果假阳性。2.4检测细胞活力鉴定此步骤是许多实验室容易忽略的重要环节，鉴定方法是：取2滴细胞悬液加一滴20g/L台盼蓝水溶液混匀，静置5min后取样作湿片镜检。活细胞排斥染料不被着色，但染料可渗入死亡细胞使细胞呈蓝色。正常情况下，活细胞的比例应不少于95%.活细胞数过低会影响对实验结果阴阳性判定。2.5加样器清洗加样前加样器一定要清洗干净,避免过多的杂质混入或造成标本间的交叉污染。笔者的经验是:第一步先用蒸馏水，目的是清洗杂质,第二步用乙醚，目的是快速挥发以干燥内壁,第三步用生理盐水，目的是再清洗。2.6补体加入量补体量必须准确加入。2007年，笔者随机选择本院门诊疑是AS患者101例，经患者同意后抽取6ml静脉血液，分为A、B、C三组，每组2ml血液，均用EDTA-K2完全抗凝，补体加入前的操作步骤严格按操作说明书操作并且保持一致，补体加入时，加入同支补体A组2ul、B组5ul、C组7ul，之后的操作步骤也严格按操作说明书操作并且保持一致。记录并统计每组实验阴性及阳性例数，回访并记录本次实验101例患者临床确诊结果。A、B、C三组的试验阳性率分别是：27.7%、32.7%、39.6%，表明三组中随着补体加入量的增加，试验阳性率增加。本次试验与丁晓燕等认为增加补体加入量，反应会更充分，可以提高阳性率的报道符合[7]。A、B、C三组试验阳性与临床确诊阳性例数吻合度分别是：82.1%、84.8%、75%，表明三组中补体加入5ul时，阳性例数中被临床确诊例数吻合率最高。A、B、C三组试验阴性例数中被临床确诊阳性的比例分别是：12.3%、5.9%、3.3%，表明三组中随着补体加入量的增加，阴性例数中被临床确诊阳性的比例减少，结果见表2。表2补体量多少与临床确诊吻合度2ul5ul7ul试验阳性28临床确诊+2333临床确诊+2840临床确诊+30临床确诊-5临床确诊-5临床确诊-10试验阴性73临床确诊+968临床确诊+461临床确诊+2临床确诊-64临床确诊-64临床确诊-59笔者的经验是：加样器的定期校正十分必要，以确保补体量的准确加入，准确统计每月临床确诊吻合度，制订每批试剂反应板不同的补体对应加入量，确保实验结果的高质量。3实验结果的质量保证3.1试验假象鉴别及避免粒细胞和单核细胞能够非特异性地吞噬染料而造成损伤的假象，明显的粒细胞和单核细胞着染能造成假阳性；血小板与淋巴细胞竞争，结合HLA-B27抗体而导致血小板着染引起假阴性；大量的红细胞沾染，很难与小淋巴细胞鉴别，易致假阳性。3.2加强对患者病情的全面了解了解患者的家族史、发病的基本症状，结合其影像学及其它方面的辅助检查，对患者的情况有一个的初步印象和基本定性。3.3加强与临床医生的沟通与信息交流及时向临床反映微量淋巴细胞毒法检测HLA-B2的原理、优缺点、临床意义等；每周回访临床医生，对所有患者的诊断符合度、对症治疗符合度进行统计，了解报告的质量水平。高质量的实验材料、规范的操作理念、良好的质量控制意识，是微量淋巴细胞毒法检测HLA-B27缺一不可的质量保证。只有做好了质量保证，才能保证检验结果能真实、客观地反映患者当前的病情或健康状况，才能保证临床医生用于患者诊断、治疗时检验结果有效、可靠。参考文献1LeirisaloR.Reactivearthritis.ScandJRheumatol，2005，34（4）：251-259.2张法尧，李洪波.强直性脊柱炎的研究进展.中医药信息，2005，22（4）：25-27.3曹孟德，秦东春，孙含笑.HLA分子生物学及临床应用.郑州:河南医科大学出版社,1998:203-204.4杨燕,李志强,徐文皓,柯梅贞,钟宁.三种方法检测HLA-B27的比较.临床输血与检验,2006，03-0210-02.5洪俊,张平安,李艳,等.强直性脊柱炎患者人类白细胞抗原-B27三种检测方法的对比.检验医学,2006，21(1):1-4.6郭嘉隆,刘峰.HLA-B27分子与血清阴性脊柱关节病.中国社区医师,2002，09-12-14.7丁晓燕，刘志琛，等.人类白细胞抗原-B27检测方法的探讨.深圳中西医结合杂志，2004，06-0156-02.8李维，王跃华，等.流式细胞术法检测人类白细胞抗原-B27的表达及意义—与微量淋巴细胞毒实验的比较.重庆医学,2006,35(11):0976-03.9方永飞,钟兵，等.应用微量淋巴细胞毒实验与流式细胞术法检测人类白细胞抗原-B27的比较.中国误诊学杂志,2004,4(8):1185-03.10樊春梅,解慧，等.流式细胞术法和微量淋巴细胞毒实验检测HLA-B27的比较.细胞与分子免疫学杂志,2002,18(6):640-01.11瞿良，王正蕙等.HLA-B27检测对强直性脊柱炎诊断的临床意义.实用医药杂志，2005，21（19）：2190-2191.附：岳文勇，男，1982.06.09，2003年毕业于河南大学医学检验系，现解放军152中心医院检验科，检验师，主要从事临床免疫检验工作。