山羊寄生虫学剖检动物医学

一例山羊寄生虫剖检林海斌12级动物医学-1指导老师：徐前明副教授摘要：对来自动物科技学院的一只山羊进行体表寄生虫检查和粪便检查以及最后的剖检。结果发现，本山羊体表有少数的虱子，粪便中未发现寄生虫虫卵和成熟的虫体，在剖检时发现本山羊血液色浅，大网膜有点状出血点，心包积液心包内有脂肪蓄积，胆囊干瘪，胆汁稀薄颜色为黄色，肠系膜血管内发现两条蛔虫幼体。将山羊的器官组织取出，进行组织学的检查，均未检测出虫体和虫卵。对本山羊的血液进行cDNA的抽取，设计引物PCR鉴定本山羊是否患有焦虫病，结果未检出。综上所述：山羊基本上处于健康状态，患有轻微寄生虫病。关键词：山羊寄生虫PCR1.材料与方法1.1器械生物光学显微镜、动物解剖器一套（解剖刀、剥皮刀、手术剪、手术刀片及刀片）、解剖针、眼科弯头镊、注射器、标本瓶、培养皿、广口瓶（60mL）、烧杯（200mL）、大白瓷盘、小白瓷盘、胶头滴管、载玻片、盖玻片、染色缸、粪筛、标本瓶、棉线、标签纸、污物桶等。1.2材料1.2.1实验动物疑是寄生虫患羊一只。1.2.2试剂无水乙醇、95%乙醇、甲醛、冰醋酸、氯化钠、甘油、乙醚、氯仿、甲醇、二甲苯、劳氏液、巴氏液、水杨酸甲酯、加拿大树胶、姬氏染液、瑞氏染液、香柏油等。1.3实验内容1.3.1病料采集对疑似有螨类寄生的皮肤病变部位,用手术刀醮取甘油溶液后刮取皮屑,装入塑料袋内,并编号。1.3.2粪样采集直接从直肠内采集粪样,装入塑料袋内,并编号。1.3.3检查方法1.3.3.1螨类检查在载玻片上滴50%甘油水溶液,取病料涂成片,置于显微镜下检查。1.3.3.2线虫卵绦虫卵检查(漂浮法)将采集好的粪样倒入洁净的小烧杯中(200mL),用筷子捣碎,用饱和盐水漂浮虫卵,再用筛子(60目/时)过滤,除去粪渣。将滤液静置30min,然后用铁丝圈沾取表层液膜检查线虫卵和绦虫卵。1.3.3.3吸虫卵检查(沉淀法)采集的粪样放入100mL烧杯中用筷子捣碎,然后放入自来水洗涤,用筛子(60目/时)过滤去粪渣。将滤液放入离心管中,2000r/min离心5minO取出离心管,弃去上清液,用皮头吸管吸取沉渣置载玻片上,滴几滴50%甘油生理盐水制成涂片置100倍显微镜下观察。1.3.4剖检将山羊进行剖检取出腹腔内的器官，观察器官的大小，形态，粘膜情况，是否有寄生虫，出血点等。对器官内容物进行反复淘洗，取淘洗液于载玻片上，在显微镜下观察，分别记录各组织器官的病变情况。1.3.5血液cDNA的抽提将250uL山羊抗凝血放于2mL一次性离心管内，加入1mL细胞裂解液，上下翻动2∽3min，彻底裂解细胞，8000rpm离心6min；弃上清，沉淀用500uL细胞裂解液冲洗后，8000rpm离心6min；弃上清，用300uLUSSTE裂解悬浮，用力震荡，加入等体积的吧饱和酚抽提，混约2min，10000rpm离心10min，将上清吸出，用等体积的氯仿异戊醇混匀2min，直到看不出白色界面10000rpm离心10min。吸取上清，加入2倍体积冷无水乙醇上下混匀，12000rpm，离心10min，弃上清，加入500uL的70%的乙醇浸洗2次，12000rpm，离心10min。弃上清，自然放置20min，待乙醇晾干后，加入50uLddH2O溶解。琼脂糖凝胶电泳检测。1.3.6PCR鉴定设计引物进行PCR鉴定，反应体系dNTP2uL，10×PCRbuffer2uL，上下游引物各1uL，cDNA0.5uL，rTaq0.5uL加dH2O至20uL。反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火56℃30s，延伸72℃1min，30个循环，最后延伸72℃8min，4℃保存。将PCR产物与2uL10×loadingbuffer混匀，琼脂糖凝胶电泳检测。2.结果2.1体表寄生虫的检查将山羊的被毛掀开，用镊子寻找体表寄生虫，并保存于标本瓶内，取虫体压片，10倍显微镜下观察，（如图1所示），山羊体表有少量血虱寄生。刮去山羊皮肤进行螨类鉴定，显微镜下观察并未发现有螨类寄生虫的寄生。2.2血液寄生虫的检查抽取山羊抗凝血，推片吉姆萨染色观察，并未发现血液中含有虫体和虫卵。2.3粪便寄生虫检查图1山羊体表的血虱10×10取山羊粪便进行漂浮法和沉淀法，取上层液和沉淀涂片显微镜下观察，并未发现虫体和虫卵。2.4系统剖检检查对山羊进行剖检，发现山羊血液色浅，大网膜上有点状出血点，心包积液，心包内有脂肪蓄积，胆囊干瘪，胆汁稀薄颜色为黄色，肠系膜血管内发现两条蛔虫幼体。将虫体分离，压片镜检（如图所示）幼虫有两厘米长度，属蛔虫幼虫二期阶段。表明山羊已感染了蛔虫，然而在其他组织内未检出虫卵虫体，尚处在初级感染阶段。2.5消化道内容物的鉴定对山羊消化道内容进行淘洗，分别选取上清和沉淀进行涂片镜检，发现，在盲肠粘膜的内容物中，发现有丝虫虫体（如图2所示），表明山羊已经感染了丝虫病但并未表现出临床症状，处于潜伏期阶段。2.6PCR鉴定焦虫病抽取山羊血液，进行cDNA的抽提(如图)，设计引物扩增焦虫的某段基因，鉴定山羊是否患有血液焦虫病，经PCR、琼脂糖凝胶电泳结果显示，山羊血液cDNA已成功被抽提出来，然而PCR鉴定结果显示，血液cDNA中不含有焦虫的cDNA，由此表明，山羊并未患有血液焦虫病。图2盲肠粘膜上的丝虫体和大网膜上的点状出血点3.结论通过上诉结果表明，本山羊总体来说是健康的，通过各项检查，判定山羊患有轻微的体表寄生虫病（虱子），血液和各系统器官的检测发现，体内寄生虫较少，没有达到危害山羊健康的程度，故此判断，此山羊轻微感染丝虫和蛔虫。无生命和健康危害。图3血液中cDNA琼脂糖凝胶电泳和焦虫病PCR检测琼脂糖凝胶电泳图A图M.Marker；1.cDNA;2.cDNA.B图M.Marker；1~4.焦虫引物PCR