川农教学实践微生物结题报告

动物微生物学及免疫学（实践教学）结题报告疑似仔猪白痢与仔猪副伤寒病死猪病料中病原菌分离鉴定班级：指导教师：时间：蒋2015年6月疑似仔猪白痢与仔猪副伤寒病死猪病料中病原菌分离鉴定指导老师：摘要：肠杆菌科的细菌种类众多，在自然界广泛分布，本实验从疑似仔猪白痢与仔猪副伤害病死猪病料中培养分离病原菌，对该细菌进行分离培养、生化鉴定、药物敏感实验和动物实验，整个实验以微生物学的知识作为理论支撑，在实验过程中运用细菌分离鉴定的基本方法，达到实验目的。关键字：仔猪白痢仔猪副伤寒大肠杆菌沙门氏菌分离鉴定1实验依据：仔猪白痢也称迟发性大肠杆菌病，是一种肠道传染病，多发于10～30日龄。临诊上以下痢、排出灰白色粥状粪便为特征。仔猪副伤寒也称猪沙门菌病，是由沙门菌引起的仔猪的一种传染病，常发生于6月龄以下仔猪，特别是2～4月龄仔猪，多见急性者为败血症，慢性者为坏死性肠炎。大肠杆菌（E.coli）和沙门氏菌(Salmonella)同属肠杆菌科，分别为埃希氏菌属和沙门氏菌属的代表菌。大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢的直杆菌，兼性厌氧，两端钝圆，散在或成对，大多数以周生鞭毛运动。碱性染料对本菌有良好的着色性，菌体两端偶尔略深染。在琼脂培养基形成圆形凸起、光滑、润湿、半透明、灰白色菌落;麦康凯琼脂上形成红色菌落；本菌能够发酵多重碳酸化合物产酸产气。大多数菌能够迅速发酵乳糖。沙门氏菌为革兰氏阴性的直杆菌，兼性厌氧。通常都以周生鞭毛运动。绝大多数发酵葡萄糖产酸产气。在三糖铁（TSI）上产生硫化氢。在肠道杆菌选择或鉴别培养基上，大多数菌因为不发酵乳糖而呈无色菌落。麦康凯琼脂上典型菌落呈透明、无色，有时带有暗色中心。2试验内容平板和斜管培养基的制备；病原菌增菌培养；病原菌分离培养；病原菌培养特性鉴定；病原菌生化鉴定；病原菌药物敏感实验。3试剂与器材材料：麦康凯琼脂粉，琼脂粉，三糖铁琼脂，亚硫酸铋(BS)琼脂，伊红美蓝琼脂，氯化镁孔雀绿增菌液，牛肉膏，蛋白胨，氯化钠，磷酸氢二钾，结晶紫，石炭酸复红，95％乙醇，革兰氏碘液，生化管（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖蛋白胨水、蛋白胨水、硝酸盐还原、硫化氢），乙醚，药敏纸片（四环素、环丙沙星、卡那霉素、青霉素、呋喃唑酮）；器材：接种环，试管，培养皿，三角瓶，电炉，天平，移液枪，PH试纸，酒精灯，玻片，显微镜，恒温培养箱，高压灭菌锅，量尺。4方法和步骤4.1平板和斜管培养基的制备根据需要制备普通琼脂培养基、普通肉汤、增菌培养基、麦康凯培养基、BS培养基、伊红美蓝培养基和三糖铁斜管培养基。将配好的培养基装入三角瓶或试管进行高压蒸汽锅内，121℃灭菌30min。待三角瓶冷却至60℃在无菌室倒平板，每个平板约15ml。4.2病原菌的增菌与分离培养无菌取病死猪心、肝病料，分别进行组织触片，自然晾干固定，美兰染色5min，冲洗后吸干镜检。将心、肝病料剪成小块，分别接种于普通肉汤、增菌培养基各1支，在37℃水浴摇床中培养24h。4.3病原菌培养特性鉴定4.3.1菌落特征观察用接种环接种增菌培养基中的菌液于普通琼脂平板、BS平板、伊红美蓝平板和麦康凯平板，各2个，37℃培养24h，观察病原菌在4种培养基上的菌落特征，并记录。发现有特征不同的多种菌落，分别取单个菌落进行镜检观察，取显微镜下符合大肠杆菌或沙门氏菌形态特征的菌落，继续纯化分离鉴定，直至得到较纯的菌。4.3.2病原菌形态染色特性鉴定分别对4种培养基的单个疑似菌落进行镜检。在洁净玻片上轻滴1滴蒸馏水，无菌勾取菌落于水中，火焰固定，结晶紫染色1-2min，洗涤，革兰氏碘液染色1-3min，洗涤，95%酒精脱色30-60s，洗涤，稀释的石炭酸复红染色10-30s，洗涤，吸干多余水分，滴加香柏油，在10×100倍的显微镜镜检，观察并绘图。4.4TSI实验取上述鉴定中符合大肠杆菌或沙门氏菌形态特征的菌落，以接种针挑取菌落涂布并穿刺接种于斜面，置36±1℃培养18-24h观察结果。4.5病原菌生化鉴定分别取大肠杆菌和沙门氏菌的合格菌进行生化实验。取生化管，在1/3-1/4处掰开，在酒精灯火焰旁，用接种针将菌落接种到11种（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖蛋白胨水、蛋白胨水、硝酸盐还原、枸缘酸盐、硫化氢）培养管生化管中，每种生化发酵管各1支，上下抽动3次接种针完成接种。每次接种前后都要对接种针进行灭菌，每次接种好一种培养管，将培养管倒插在泡沫板上。37℃培养48h，观察并记录结果。4.6药敏试验4.6.1操作方法将两种菌分别用灭菌接种环致密划线于琼脂平板表面（可重复来回划线），用无菌镊子将各种抗菌药物圆纸片，分别贴于培养基表面，各片距离要相等。37℃培养24h观察结果。4.6.2结果判定根据药物纸片周围有无抑菌圈及其直径大小，来判断该菌对各种药物的敏感程度，分为高度敏感、中度敏感、低度敏感和不敏感四种.表1抗生素敏感度的标准抑菌圈直径（mm）敏感度20极度敏感15~20高度敏感10~14中度敏感0~10低度敏感0不敏感5实验结果5.1组织触片美兰染色镜检结果在10×100倍的显微镜下观察到符合要求的细菌，同时也有其他类型的杂菌存在。5.2培养特性结果分离纯化培养得到两种疑似菌落。A型菌落：平板特征普通琼脂麦康凯BS伊红美蓝大小中等菌落中等菌落针尖状菌落小菌落形状圆形圆形圆形圆形边缘整齐整齐整齐整齐隆起度扁平低凸扁平扁平透明度半透明不透明半透明不透明黏稠度黏稠黏稠黏稠黏稠表面形状光滑光滑光滑光滑颜色淡黄色玫红色灰色绿色，金属光泽图片B型菌落：平板普通琼脂麦康凯BS伊红美蓝特征大小中等菌落小菌落小菌落小菌落形状圆形圆形圆形圆形边缘整齐整齐整齐整齐隆起度扁平扁平隆起低隆透明度半透明不透明不透明不透明黏稠度黏稠黏稠黏稠黏稠表面形状光滑光滑光滑光滑颜色淡黄色浅啡色黑褐色灰白色图片5.3纯化后病原菌革兰氏染色镜检结果两种疑似菌：形态特征相似，粉红色，杆状，无荚膜，无芽孢，但是A细菌稍长，B细菌稍短。5.4TSI结果A图片B图片产气产气产气硫化氢不产生产生颜色全部变黄色斜面变红色试管变黄穿刺线颜色无变化变黑色5.5生化实验结果5.6药敏实验结果种类药敏纸片AB抑菌圈直径（mm）敏感度抑菌圈直径（mm）敏感度四环素6低度敏感6低度敏感环丙沙星6低度敏感28极度敏感卡那霉素6低度敏感23极度敏感青霉素6低度敏感6低度敏感呋喃唑酮19高度敏感21极度敏感6讨论分析6.1实验结果分析6.1.1组织触片镜检结果分析因病料放置在室温温度下的时间较久，且与空气直接接触，故有许多空气中的杂菌落入病料中，难以判断病料中的病原菌种类，故进行普通肉汤及增菌培养。6.1.2培养特性结果分析纯化分离培养得到A和B两种类型菌落，因其在普通培养基上形状特征相似，而在麦康凯培养基上，A细菌菌落为玫红色，B为浅咖色；在BS培养基上，A为浅棕色B为黑色；在伊红美蓝培养基上，B细菌菌落明显出现金属光泽。故A菌有可能是大肠杆菌，B菌有可能为沙门氏菌。6.1.3纯化后病原菌革兰氏染色镜检结果分析两种菌在革兰氏染色镜检下形态特征相似，粉红色，杆状，无荚膜，无芽孢的革兰氏阴性菌，但是A细菌稍长，B细菌稍短。故根据革兰氏染色的形态特征无法判断葡萄糖乳糖蔗糖麦芽糖甘露醇A+++++B+--++MRVP吲哚枸缘酸盐硝酸盐还原硫化氢A+-+-+-B+---++A和B分别为何种菌。6.1.4TSI结果分析在三糖铁试验中，A细菌试管产气，培养基变黄，穿刺线五颜色变化，故初步判定其为大肠杆菌；B细菌试管产气，斜面变红，培养基变黄，穿刺线变黑，故初步判定其为沙门氏菌。进一步对A和B进行生化鉴定。6.1.5生化实验结果分析在生化鉴定实验中，A和B细菌在乳糖、蔗糖、硫化氢、吲哚生化管中有明显的差异，结合之前的鉴别培养基菌落特征、三糖铁实验，基本判断A菌是大肠杆菌，B菌为沙门氏菌。6.1.6药敏实验结果分析根据药敏实验结果可以判断，大肠杆菌（A）对四环素、环丙沙星、卡那霉素和青霉素低度敏感，对呋喃唑酮高度敏感；沙门氏菌（B）对四环素和青霉素低度敏感，对环丙沙星、卡那霉素和呋喃唑酮极度敏感。在选取治疗药物上，仔猪白痢应该选取呋喃唑酮进行治疗，效果较好；仔猪副伤寒应该选取环丙沙星、卡那霉素和呋喃唑酮进行治疗，效果较好。6.1.7综合结论通过进行病原菌分离、生化鉴定及药敏实验，达到了实验的预期效果，实验结果与预期理论结果相符。可以判断病死猪病料中既含有大肠杆菌又有沙门氏菌，该猪综合感染仔猪白痢和仔猪副伤寒致死。6.2误差分析6.2.1开始分离的沙门氏菌中总是含有大肠杆菌原因：接种环未勾取单个菌落。6.2.2平板上没有长出菌落原因：接种环太烫，未冷却勾取菌落，造成高温杀死病原菌。6.2.3平板上长出成片细菌，没有单个菌落原因：接种时勾取的细菌太多或接种时划线太疏。6.2.4生化试验结果与理论不符原因：高温杀死细菌或者杂菌污染影响实验结果。7疾病的预防与治疗7.1仔猪白痢预防与治疗加强饲养管理：搞好环境卫生，注意保暖通风。采用“自繁自养”、“全进全出”的管理模式，完善种猪引进检疫隔离制度。供给妊娠母猪和哺乳母猪全价饲料，促使母猪分泌好的乳汁，保证仔猪的营养需要。对于初生仔猪，应尽快吃上和吃足初乳，提高被动免疫力，在2周龄左右合理补饲全价仔猪日粮，以满足仔猪机体快速发育对糖、蛋白质、矿物质等营养的需要。同时夏季加强通风降温等防暑工作，冬季应加强圈舍保暖。保持圈舍清洁卫生，临产时用0.1%的温热高猛酸钾溶液擦洗母猪外阴和腹下的乳房区，防止病从口入。免疫接种可明显降低仔猪白痢的发病和死亡率：用仔猪大肠杆菌三价苗在母猪临产前20天肌肉注射2头份，能够有效的防治仔猪白痢的发生，从而起到了明显的效果。药物治疗：用长效沙星注射液，配合654-2注射液，治疗仔猪白痢疗效确切。其他在发病期间，饮水添加0.1%高锰酸钾，再加入少许食盐，对本病治疗起辅助作用，同时也补充了电解质，防止脱水。7.2仔猪副伤寒预防与治疗免疫注射：应用仔猪副伤寒疫苗进行接种，在断奶后各免疫1次，中间隔离3～4周，每次剂量不少于4～5ml，在副伤寒危害严重的地方有计划的预防注射，能有效的控制该病的发生。加强饲养管理：给予全价优质的饲料，出生仔猪要尽快尽早吃初乳，提前补料，断奶后合群时不要突然改变环境，猪群数量不宜过大，以免发生拥挤，潮湿等。保持圈舍及环境卫生，定期用消毒药喷洒猪栏，运动场及墙壁，食槽等经常洗刷，给予清洁饮水，粪便发酵处理。当有猪发病时病猪应及时隔离，圈舍用10%石灰乳或3%草木灰进行消毒，病猪进行治疗，可采取肌肉注射土霉素液或安乃近注射液，每天早晚各一次，用药3～5天病情可以好转，死猪进行深埋等无害化理。对未发病的猪可采取药物预防，在每吨饲料加入金霉素100g或磺胺二甲嘧啶100g可起一定的预防作用。8时间安排2015年6月8—12日撰写开题报告2015年6月15日培养基的制备，病料的肉汤和増菌培养2015年6月16-17日疑似细菌筛选、纯化，镜检2015年6月18日生化鉴定实验2015年6月19日药敏试验参考文献:[1]陆承平.兽医微生物学[M].第五版.北京:中国农业出版社,2012.[2]姚火春.兽医微生物学实验指导[M].第二版.北京:中国农业出版社,2002.[3]蔡宝祥.动物传染病诊断[M].南京:江苏科学技术出版社,1993.[4]梁崇杰.仔猪大肠杆菌病及其防治[S].四川:四川科学技术出版社,2009.[5]张耀相.猪伤寒沙门氏菌的分离与鉴定[M].黑龙江:黑龙江畜牧兽医,2003.