常见血液肿瘤FISH检测小册

常见血液肿瘤FISH检测小册一.FISH是什么FISH即荧光原位杂交技术（Fluorescenceinsituhybridization），是在细胞遗传学水平上检测染色体及基因数目和结构异常的一种分子病理检测技术。其基本原理是利用标记了荧光素的核酸作为探针，按照碱基互补原则，与待检样本中与之互补的核酸经过变性-退火而形成杂交双链核酸，然后通过荧光显微镜进行检测和分析。FISH技术具有直观、快速、敏感性高和方便灵活等特点，目前已经广泛应用于临床的肿瘤遗传学及各种基因相关疾病的分型与个体化治疗等多个领域。二.血液肿瘤的诊断分型MICM：血液肿瘤诊断的精确分型是临床选择正确治疗方案的前提，目前国际上通用的是结合细胞形态学（Morphology）、免疫学（Immunology）、细胞遗传学（Cytogenetics）和分子生物学（Molecular）的MICM分型。形态学诊断(Morphology)细胞学：外周血、骨髓涂片，淋巴结穿刺组织学：骨髓、淋巴结活检免疫学检查(Immunology)免疫组化（IHC），流式细胞（FCM）细胞遗传学检查(Cytogenetics)核型分析，荧光原位杂交（FISH）分子生物学检查(Molecular)PCR，DNA测序三.FISH技术的作用及优势FISH作为一项很重要的分子遗传学检测技术，在血液肿瘤的诊断中有很大的作用，得到了NCCN等国内外各大血液肿瘤诊疗指南的认可和建议。目前与血液肿瘤相关的FISH探针有接近100种，常用的就有60种左右，包括急慢性白血病、骨髓增生异常综合症（MDS）、多发性骨髓瘤（MM）、淋巴瘤等多种血液肿瘤。FISH技术的相对优势：FISH技术更敏感，可检测出核型分析检测不出的细微缺失或易位，如MDS中的5q缺失综合征；FISH技术不需要中期分裂相细胞，而核型分析需要培养时间较长且需要较高的操作要求；FISH技术是在细胞形态的基础上进行结果判读，可有效地降低假阴性或假阳性的风险，而PCR技术经过倍增扩增，不能在形态的基础上判读，对实验要求高，易产生假阴性或假阳性。四.常用的血液FISH检测探针1急性粒细胞白血病（AML）：样本建议骨髓□AML1/ETO融合基因（M2b分型）□PML/RARA融合基因（M3分型）□CBFB基因断裂（M4分型）□KMT2A（MLL）基因断裂（预后差，治疗失败风险高）□其他：□8号染色体、□CBFB/MYH11基因融合、□RARA基因断裂、□5q缺失、□7q缺失、□EVI基因断裂2慢性粒细胞白血病（CML）：样本优先骨髓□BCR/ABL（DF）融合基因检测（指导格列卫用药）□嗜酸性粒细胞增多症（格列卫作用靶标）：□PDGFRA基因断裂、□PDGFRB基因断裂、□FGFR1基因断裂□其他：□BCR/ABL（ES）、□BCR/ABL（SF）、□i（17q）、□ASS基因缺失3急性淋巴细胞白血病（ALL）：样本建议骨髓□ETV6（TEL）/AML1融合基因（预后较好，但易复发）□TCF3（E2A）基因断裂（标准化疗后易早期复发）□BCR/ABL融合基因（易迅速复发，对挽救性化疗反应不佳）□儿童急性淋巴细胞白血病染色体及基因异常（4、10、17、TEL/AML1、KMT2A基因断裂、BCR/ABL（DF），预后评估及治疗方案的选择）□其他：□TCF3（E2A）/PBX1、□4、10、17；□MYC基因断裂、□IGH基因断裂、□KMT2A基因断裂、□CDKN2A（P16）基因缺失4慢性淋巴细胞白血病（CLL）：样本优先外周血或骨髓□慢性淋巴细胞白血病染色体及基因异常（P53、RB1（13q14）、ATM（11q22）、D13S25（13q14）、12，预后评估及治疗方案的选择）□其他：□DLEU1（13q14）、□P53、□ATM（11q22）、□MYC基因扩增、□6q、□TERC、□GLI、□12、□BCL2/IGH、□CCND3/IGH5骨髓增生异常综合症（MDS）：样本建议骨髓□骨髓增生异常综合症染色体及基因异常（5q、7q、20q、8、X/Y，预后评估及治疗方案的选择）□其他：□5q、□7q、□20q、□EGR1、□EVI1基因断裂、□X/Y6多发性骨髓瘤（MM）：样本建议骨髓□多发性骨髓瘤染色体及基因异常（P53、1q21、RB1（13q14）、D13S319（13q14）、IGH，预后评估及治疗方案的选择）□其他：□CCND1（BCL1）/IGH、□MAF/IGH、□FGFR3/IGH、□MAFB/IGH、□CCND3/IGH、□11q23及DLEU1、□P53、□15q22及6q21、□1q21及1p36、□IGH基因断裂7淋巴瘤：样本建议骨髓或淋巴结穿刺□MYC/IGH融合基因（辅助诊断伯基特淋巴瘤、高分级B细胞淋巴瘤的治疗）□BCL2/IGH融合基因（辅助诊断滤泡性淋巴瘤）□ALK基因断裂（辅助诊断间变性大细胞淋巴瘤，指导克唑替尼用药）□CCND1（BCL1）/IGH融合基因（辅助诊断套细胞淋巴瘤，鉴别诊断MCL和CLL）□IGH基因断裂（发生于多种类型的淋巴瘤中，与超过50种基因融合）□MALT1基因断裂（辅助诊断粘膜相关淋巴组织淋巴瘤，指导HP化疗方案）□BCL6基因断裂（DLBCL中预后较佳，指导治疗方案）8骨髓移植后嵌合状态监测（X、Y）□X和Y染色体检测五.常见血液肿瘤FISH探针介绍血液肿瘤中常见FISH探针有四种类型，应用于基因融合、断裂、扩增和缺失检测。检测类型探针举例所含靶标正常信号典型异常信号基因融合BCR/ABL（DF）融合基因检测探针GSPBCRGSPABL1基因断裂IGH基因断裂检测探针GSPIGH基因扩增MYC基因扩增检测探针GSPMYCCSP8基因缺失P53基因缺失检测探针GSPP53CSP17注：*红色标记表示该基因探针标记红色荧光素（R），荧光显微镜相应滤块下观察为红色信号点（某些参数滤块下显示为橙色信号）；*绿色标记表示该基因探针标记了绿色荧光素（G），荧光显微镜相应滤块下观察为绿点信号点；*黄色标记表示该基因探针包含一组分别标记了红、绿两种荧光素的探针组合，荧光显微镜单通道滤块下可观察到相应颜色信号点（绿色或红色信号点），双通道滤块下可观察到红绿相邻或重叠信号（融合，F）。1.急性粒细胞白血病（AML）常用FISH检测靶标：AML1/ETO基因融合、PML/RARA基因融合、CBFB基因断裂、MLL基因断裂AML1/ETO融合基因检测—M2b分型的标志1）辅助诊断：AML1/ETO融合基因在M2患者中的发生率20%-40%，在M2b亚型中发生率高达90%，是M2b分型的标志，在M1和M4中少见。2）判断预后：AML1/ETO融合基因阳性是预后好的标志，患者对治疗反应佳，完全缓解率可达90%，5年无病生存可达50%-70%。PML/RARA融合基因检测—M3分型的标志1）辅助诊断：PML/RARA融合基因可见于95%以上的APL中，成为M3的一个特异标志，预后好，约占全部AML的9%。2）指导用药：全反式维甲酸（ATRA）和三氧化二砷能靶向降解PML/RARA融合蛋白，恢复野生型PML和RARA基因功能，解除其对基因转录的抑制，诱导细胞发生分化和凋亡，使APL得到有效治疗。ATRA与化疗联合使用可使APL的完全缓解率达90%-95%，并可使70%以上的患者得到长期生存。CBFB基因断裂—M4E0特征性的遗传学改变1）辅助诊断：CBFB基因断裂重组是AML的特征性染色体异常，占总AML患者的5%-10%和23%的M4患者，通常见于AML-M4E0亚型，在M2，M5及M4（无嗜酸性粒细胞增多）中较少。现在认为CBFB基因断裂重组是M4E0特征性的遗传学改变。2）判断预后：大多数CBFB基因断裂重组的AML患者对化疗敏感、预后较好。MLL基因断裂1）辅助诊断：在成人急性髓细胞白血病(AML)中，则主要见于M4/M5亚型。2）判断预后：除t(9；11)，t(10；11)以外，大部分MLL重排白血病缓解率低，并且第一次缓解后极易复发，生存期短，预后很差。在AML中单纯MLL断裂提示预后中等。2.慢性粒细胞白血病（CML）常用FISH检测靶标：BCR/ABL基因融合BCR/ABL融合基因检测—CML诊断的“金标准”1）辅助诊断：t(9；22)(q34；q11)易位形成的BCR/ABL融合基因是CML的标志物，95%CML患者可检测出典型的t(9；22)(q34；q11)易位，约5%的CML患者通过核型分析难以检测到Ph染色体，但可检测出融合基因存在，仍被归为Ph+CML分类。2）指导用药：对初诊患者进行BCR/ABL检测，可以进行酪氨酸激酶抑制剂受益人群筛查。格列卫可用于治疗费城染色体阳性的慢性髓性白血病(Ph+CML)的慢性期、加速期或急变期。3）疗效监测：Ph染色体存在于CML的整个病程中，治疗缓解后，仍持续存在，只有消除Ph阳性克隆，才能达到最终治愈。FISH可用于治疗期间患者体内BCR/ABL融合基因细胞量动态变化的检测，用于后续的治疗方案选择及药物使用效果评估。3.嗜酸粒细胞增多症（HE）常用FISH检测靶标：PDGFRA基因断裂、PDGFRB基因断裂和FGFR1基因断裂2008年WHO将具有PDGFRA、PDGFRB或FGFR1基因断裂异常，伴嗜酸性粒细胞增多的髓系和淋巴系肿瘤独立成一个新类“Myeloid/lymphoidneoplasmswitheosinophiliaassociatedwithrearrangementsofPDGFRA,PDGFRB,orFGFR1”。这类患者具有PDGFRA基因重排、PDGFRB基因重排或FGFR1基因重排，即使不伴有BCR/ABL融合基因，依然对酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼（imatinib）治疗敏感，治疗后完全缓解率高。4.急性淋巴细胞白血病（ALL）常用FISH检测靶标：ETV6（TEL）/AML1基因融合，TCF3（E2A）基因断裂，BCR/ABL基因融合，KMT2A（MLL）基因断裂及4、10、17号染色体数目异常ALL中遗传学改变发生的频率可达80%-90%，遗传学变异较大，但大部分是特异性改变，与特定的形态学和免疫学表型有关。ALL中遗传学改变主要是两种形式，一是染色体结构异常，二是染色体数目的异常。ETV6（TEL）/AML1基因融合ETV6（TEL）/AML1融合基因在儿童ALL中的发生率高达20%-25%，是目前儿童ALL最常见的染色体重排。大多数研究发现ETV6（TEL）/AML1阳性的儿童ALL治疗效果很好，5年EFS和总生存率达到89%和97%，是预后良好的指标之一。TCF3（E2A）基因断裂约3%-5%的儿童ALL携带E2A基因断裂。早期研究认为TCF3（E2A）/PBX1阳性的ALL患儿易发生早期复发，预后不佳，故曾将其作为高危因素之一。核型分析容易导致20%-25%漏诊，而FISH可克服这一缺点。BCR/ABL基因融合t(9；22)易位形成的BCR/ABL融合基因，约25%成人ALL及2-10%儿童ALL出现t（9；22）易位，但已被认为是最重要的预后不良的因素之一。一旦检测出BCR/ABL融合基因，患儿即被划分为高危，接受更为强烈的化疗或造血干细胞移植。但大多数患儿仍会治疗失败，5年EFS只有28.6%。MLL基因断裂MLL基因改变在急性白血病中的发生率约为5%-10%，但在婴儿ALL中则高达79%。t(4；11)(q21；q23)易位形成的MLL/AF4融合基因最为常见(占41%)，是预后不良的重要标志，5年EFS只有26.7%。4、10、17号染色体异常儿童ALL约25%有染色体数目的增加，以4、10、17号染色体受累较为多见。4、10和17染色体三体是独立的预后良好的指标，这类患者7年EFS大于90%。5.慢性淋巴细胞白血病（CLL）常用FISH检测靶标：13q-，+12，17p-，11q-慢性淋巴细胞白血病是一种进展缓慢、惰性的肿瘤，约占所有白血病的30%，多起源于B细