支原体菌属研究进展

微生物分类结业论文学号：20114081204支原体菌属研究进展学生姓名：尘顺指导教师：孙冬梅所在学院：生命科学技术学院专业班级：2011级生物技术（试点）班中国·大庆2013年12月支原体菌属研究进展摘要：支原体感染与临床多种疾病密切相关。近年来，随着诊断技术的提高和研究的深入，支原体感染尤其引起人们的重视。本文介绍了支原体的流行病学、致病性、检测方法及治疗等情况，对以上方面的新进展作一综述。关键词：支原体，感染，检测1分类研究支原体是在1898年发现的，是一种简单的原核细胞。其大小介于细菌和病毒之间。结构也比较简单，多数成球形，没有细胞壁，只有三层结构的细胞膜故具有较大的可变性。支原体可以在特殊的培养基上接种生长，用此法配合临床进行诊断。与泌尿生殖道感染有关的主要是分解尿素支原体和人型支原体两种，约有20-30%的非淋菌性尿道炎的病人，是由以上两种支原体引起的，是非淋菌性尿道炎及宫颈炎的第二大致病菌。在成年人的泌尿生殖道中分解尿素支原体和人型支原体感染率主要与性活动有关，也就是说，与性交次数的多少、性交对象的数量有关，不管男女两性都是如此。2生态学特征2.1形态与结构支原体的大小为0.2～0.3um,可通过滤菌器，常给细胞培养工作带来污染的麻烦。菌落小（直径0.1~1.0mm），在固体培养基表面呈特有的油煎蛋状。无细胞壁，不能维持固定的形态而呈现多形性，对渗透压敏感，对抑制细胞壁合成的抗生素不敏感。革兰氏染色不易着色，故常用Giemsa染色法将其染成淡紫色。细胞膜中胆固醇含量较多，约占36%，对保持细胞膜的完整性具有一定作用。细胞膜含甾醇，比其他原核生物的膜更坚韧。凡能作用于胆固醇的物质（如二性霉素B、皂素等）均可引起支原体膜的破坏而使支原体死亡。支原体基因组为一环状以双链DNA，分子量小（仅有大肠杆菌的五分之一），合成与代谢很有限。肺炎支原体的一端有一种特殊的末端结构（terminalstructure），能使支原体粘附于呼吸道粘膜上皮细胞表面，与致病性有关。2.2培养要求营养要求比一般细菌高，除基础营养物质外还需加入10～20%人或动物血清以提供支原体所需的胆固醇。最适pH7.8～8.0之间，低于7.0则死亡，但解脲支原体最适pH6.0～6.5。大多数兼性厌氧，有些菌株在初分离时加入5%CO2生长更好。生长缓慢，在琼脂含量较少的固体培养基上孵育2～3天出现典型的“荷包蛋样”菌落：圆形（直径10～16um），核心部分较厚，向下长入培养基，周边为一层薄的透明颗粒区。此外，支原体还能在鸡胚绒毛尿囊膜或培养细胞中生长。2..3繁殖方式繁殖方式多样，主要为二分裂繁殖，还有断裂、分枝、出芽等方式，盖因缺乏细胞壁造成分裂时二个子细胞大小均所致。同时，支原体分裂和其DNA复制不同步，可形成多核长丝体。细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。国内外研究表明，95%以上是以下四种支原体：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和莱氏无胆甾原体（A.laidlawii），为牛源性。以上是最常见的污染细胞培养的支原体菌群，但能够污染细胞的支原体种类是很多的，国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体3检测方法随着各种检测支原体方法的相继建立，支原体的检出率大为提高，给临床的诊治带来了很大方便。目前用于检测支原体感染的实验诊断方法主要有以下几种：3.1培养法支原体营养要求较高，大多数能利用葡萄糖和精氨酸作为能源，而Uu和Mh可利用尿素为能源，分解尿素产氨和二氧化碳，使pH值升高，含酚红指示剂的培养液由黄色变红色。所有国内外商品化的支原体肉汤培养基都是根据这个原理设计的。但是仅凭培养基颜色变化来诊断是不可靠的，因为可能有细菌或真菌污染导致假阳性，也有些支原体因不能分解尿素而出现假阴性[1]。因此可靠的方法是将增菌培养物再转种到琼脂固体培养基孵育，观察其典型菌落形态，最终的鉴定应当依据其菌落形态和有关生化反应。国内的很多文献报道中都是仅凭培养基颜色变化来做判断，很容易导致误判，故应引起广泛重视[2]。3.2血清学检查包括补体结合试验、冷凝集试验、凝集试验以及酶联免疫吸附试验等，是目前诊断支原体感染的重要手段。3.3分子诊断技术PCR诊断技术自1985年问世以来得到广泛应用，该技术在支原体的感染诊断中也得到较好应用。在此基础上，之后又相继建立了套式PCR技术（nPCR）、荧光定量PCR技术（FQ-PCR）等，提高了检测的灵敏度、特异度和准确性，成为常规PCR技术的改良。近年来出现了一种新的支原体检测技术—支原体反向线点杂交（reverselineblothybridization，RLB）。其原理类似于基因芯片，即设计支原体种特异性探针并标记在尼龙膜上，扩增支原体靶序列与其种特异性探针杂交，通过不同位置的杂交结果鉴定支原体。国内已有相关报道。王辉等[3]应用支原体反向线点杂交和种特异性PCR方法同时检测198例临床标本，比较两种方法的检测结果，发现两种方法检测结果符合率为98.5%，检测结果差异无显著性，但反向线点杂交方法在支原体16s—23srRNA间隔区设计种特异性探针，能在2天内同时敏感和特异地检测、鉴定支原体，提高了临床检测效率，能够更灵敏、快速地进行临床支原体标本的分种鉴定。标记支原体种特异性的尼龙膜能被反复使用20次，每次可同时检测45个样本，大大降低了每一个样本的检测成本，且检测结果可凭肉眼直接在曝光的底片上观察，更便于临床操作，因此是一种值得临床推广的较好方法。4流行病学4.1支原体感染的症状潜伏期为1-3周，典型的急性期症状与其他非淋病性生殖泌尿系统感染相似，表现为尿道刺痛，不同程度的尿急及尿频、排尿刺痛，特别是当尿液较为浓缩的时候明显。尿道口轻度红肿，分泌物稀薄，量少，为浆液性或脓性，多需用力挤压尿道才见分泌物溢出，常于晨起尿道口有少量粘液性分泌物或仅有痂膜封口，或见污秽裤裆。亚急性期常合并前列腺感染，患者常出现会阴部胀痛、腰酸、双股内侧不适感或在做提肛动作时有自会阴向股内侧发散的刺痛感。女性患者多见以子宫颈为中心扩散的生殖系炎症。多数无明显自觉症状，少数重症病人有阴道坠感，当感染扩及尿道时，尿频、尿急是引起病人注意的主要症状。感染局限在子宫颈，表现为白带增多、混浊、子宫颈水肿、充血或表面糜烂。感染扩及尿道表现为尿道口潮红、充血、挤压尿道可有少量分泌物外溢，但很少有压痛出现。支原体感染常见的合并症为输卵管炎，少数患者可出现子宫内膜炎及盆腔炎。4.2诊断支原体实验室检测方法有：形态学检查、支原体培养、抗原检测、血清学方法和分子生物学方法。解脲支原体MB抗原的研究表明：MB抗原是解脲支原体感染时被识别的主要外膜抗原，具有种特异性，包含血清特异的和交叉反应的抗原决定簇。编码MB抗原的基因长1200多个碱基、N端1/3为保守区，包含群特异的抗原决定簇：C端2/3是由重复序列组成的可变区，包含型特异的抗原决定簇，对该抗原的研究及对于研究疾病的发病机制和免疫机制起重要作用。MB抗原位于解脲支原体膜的表面，N端固定于膜上使C端重复区暴露于微生物周围的微环境。N端可以作为其分群分型的基础，C端最可能首先与宿主的防御系统相遇而引起主要的抗体反应，是理解它的发病机制和免疫机制的基础。MB抗原与疾病的关系，以及它在疾病中的作用还有待进一步探讨。测定支原体抗体的血清学试验方法中，有支原体特异性血清学检测和非特异性血清学检测：支原体特异性血清学检测方法中，最常用的是补体结合试验，另有间接免疫荧光染色检查法、生长抑制试验、代谢抑制试验、间接血凝试验、酶免疫法和酶联免疫吸附试验（ELISA）等。支原体的非特异血清学方法有肺炎支原体冷凝集试验与MG链球菌凝集试验，对支原体肺炎能起辅助诊断的作用。检测特异性抗体IgG的方法尚不能达到早期快速诊断的目的，抗原的检测为今后研究的发展方向。目前已有用酶联免疫吸附试验、荧光标记抗体、肺炎支原体膜蛋白单克隆抗体和反向间接血凝法直接检测分泌物和体液中支原体抗原的报道，具有很高的特异度和灵敏度。人体感染肺炎支原体后，能产生特异性IgM和IgG类抗体。IgM类抗体出现早，一般在感染后1周出现，3～4周达高峰，以后逐渐降低。由于肺炎支原体感染的潜伏期为2～3周，当患者出现症状而就诊时，IgM抗体已达到相当高的水平，因此IgM抗体阳性可作为急性期感染的诊断指标。如IgM抗体阴性，则不能否定肺炎支原体感染，需检测IgG抗体。IgG较IgM出现晚，需动态观察，如显著升高提示近期感染，显著降低说明处于感染后期。·PCR技术检测为进一步早期诊断MP感染提供可能。应用PCR的敏感性和探针杂交的特异性合二为一，是目前公认的准确性和重复性最好的检测。5致病机理致病支原体中，肺炎支原体起肺炎，人型支原体、解脲支原体和生殖器支原体主要泌尿生殖道感染。支原体肺炎又称原发性非典型肺炎，支原体肺炎全年均可发病，以冬季多见，可有小流行。支原体肺炎是学龄前儿童及青年人常见的一种肺炎，支原体肺炎主要通过飞沫传播，潜伏期较长，可达2～3周。支原体肺炎虽然病程较长，肺部病变较重，炎症吸收较慢，但绝大多数预后都是良好的，合并症亦少。生殖器支原体感染是近年新明确的一种性接触传播疾病。成人主要通过性接触传播，新生儿则由母亲生殖道分娩时感染。成人男性的感染部位在尿道粘膜，女性感染部位在宫颈。新生儿主要引起结膜炎和肺炎。解脲支原体（ureaplasmaure-alyticum）是一种原核微生物，呈球杆状，大小为125-250毫微米，分子量4.5*108，高度多形性，没有坚硬的细胞壁，能在无细菌的培养物中增殖，能产生尿素分解酶分解尿素。特异性抗体能抑制它生长，因其缺乏坚硬的细胞膜，对青霉素耐药，对细胞膜有亲和性，生长繁殖时需要类固醇物质。婴儿或无性交接触的女性生殖道内找不到解脲支原体。而性生活越乱，这种支原体阳性率也越高。McDonald1982年报告587例急性尿道炎症状病人中，209例（36%）中段尿中分离出解脲支原体。人型支原体（mycoplasmahominis）支原体对外界环境抵抗力弱，45℃15min即可被杀死。支原体只能粘附在呼吸道或泌尿生殖道的上皮细胞表面的受体上，而不进入组织和血液。支原体引起细胞损害的原因为：粘附于宿主细胞表面的支原体从细胞吸收营养，从细胞膜获得胆固醇等脂质，引起细胞损伤；支原体代谢产生的有毒物质，如溶神经支原体能产生神经毒素，引起细胞膜损伤；脲原体含有尿素酶，可以水解尿素产生大量氨，对细胞有毒害作用。支原体除可以粘附于细胞、巨噬细胞表面外，还可以粘附于精子表面，从而阻止精子运动，其产生神经氨酸酶样物质可干扰精子与卵子的结合。这就是支原体感染引起不育不孕的原因之一。在动物实验发现，小鼠腹腔巨噬细胞可以杀灭支原体，而中性粒细胞的作用不大。在体外，IgG1和IgG2抗体有调理作用。可加强巨噬细胞对支原体的杀伤作用。6治疗情况6.1抗生素治疗支原体缺乏细胞壁结构，故能阻碍病原微生物细胞壁合成的抗生素如青霉素类、头孢菌素类等对支原体感染无效。目前临床上较常应用的药物主要有四环素类、大环内酯类及喹诺酮类[4]。但不同的抗生素对于特定的支原体抑制反应有所不同，同时支原体也会对选择使用的药物产生耐药性，故使得各种支原体的治疗变得复杂及针对性强。近年来出现了很多人工合成的抗生素，对支原体感染的治疗效果较好。仇玉桃[5]对大庆地区70例支原体肺炎患者采用阿齐霉素序贯疗法进行治疗，治愈率为94%，且不良反应较小，效果较好。李建开等[6]对天津滨海地区Uu和Mh感染患者进行支原体药敏分析，显示敏感药首选为美满霉素、强力霉素，其次为交沙霉素、司帕沙星。而王建等[7]对内蒙古通辽地区的检测结果显示，敏感程度居前三位的药物分别是强力霉素、美满霉素、克拉霉素，而司帕沙星的耐药率达46.0%，阿齐霉素的耐药率为28.0%，这表明各地区支原体感染的耐药性各有差异，故临床医生应在药敏试验结果的指导下，正确合理使用药物，以避免或降低耐药现象的发生