干细胞笔记

经过第一次传代培养，原代培养物就被称为一个细胞系。细胞培养中，一些细胞可形成连续细胞系。人类成纤维细胞在培养中一直维持其整倍性，不会转化成连续细胞系。小鼠成纤维细胞和一些人类动物肿瘤细胞，一般难以维持其染色体的整倍性，常产生连续细胞系。许多人类连续细胞系的共性就是出现四倍体的染色体数目。这种通过培养导致的连续细胞系变化叫体外转化。转化是指生长特性的改变。永生化指xibao获得无限增值和永久的生存能力。体外培养细胞的能量代谢：多数培养基含4-20mol/l的葡萄糖，用作糖酵解的碳源。柠檬酸循环-谷氨酰胺脱氨作用产生氨，氨对细胞有毒抑制细胞生长。在培养基中加入某些二肽如（life生产的glutamax培养基），谷氨酸-丙氨酸或谷氨酸-甘氨酸，可减少氨的生成。群体倍增时间：细胞处于对数生长期时，细胞数增加一倍所用时间。细胞代增时间:细胞两次分裂之间的时间间隔即为细胞代增时间。原代培养：即直接从有机体取下细胞，组织或器官，使它们在体外维持和生长。细胞系：原代培养在第一次传代后就成为细胞系。它的生存期可以是有限的，也可以是连续的。细胞株：由来自细胞系的具有特殊性质或特别标记的细胞所形成，它也可以是有限的或是连续的。培养基：如MEM,DMEM,F12,RPMI-1640,McCOY5A,L15等。每升培养基中加入2.2gNaHCO3,比常规的3.7g效果好。血清试用效果：可用细胞的克隆形成率检测。取对数期的干细胞，彻底消化后，以低密度（直径6mm的平皿中加约103个细胞）接种5-6个平皿，其中一个平皿含30%血清的培养基，以测定高浓度时血清的细胞毒作用。7-10d后，出现肉眼可见克隆时，倒掉培养液，2%美蓝染色2-5min，观察克隆形态，计数克隆形成率。克隆形成率一般在5%-10%之间。白血病抑制因子LIF,又称DIA是一种分泌型多肽，可抑制干细胞的自然分化。可用纯化的LIF直接加入培养基中，或使用LIF表达载体转染过的滋养层细胞。纯化的LIF非常昂贵，正常的STO细胞也可分泌。重组LIF来源方便。与STO细胞一起使用时，常用浓度为1000U/ml。与小鼠胚胎成纤维细胞一起使用时，常用浓度为500U/ml。抗生素：常用青霉素，链霉素，卡那霉素，庆大霉素，青霉素常用剂量100U/ml。链霉素常用剂量是100ug/ml.常配成100或200倍，分装为小包装，-20°C保存。一次用一包装，避免反复冻融。消化液：0.25%或0.125%的胰酶和0.02%的EDTA二钠溶液。用无钙镁的磷酸缓冲液PBS配制。它们可单独使用也可按比例混合后使用。常规饲养层细胞消化可使用终浓度为0.05%胰酶和0.02%EDTA混合液。胚胎干细胞传代时需分离干细胞球，或胚胎干细胞的原代分离培养时，消化液可浓度较高，如0.25%胰酶-0.04%EDTA混合液（HanKs液配制）。干细胞分离和鉴定：干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。祖细胞：在干细胞的发育过程中，还存在一种中间类型的细胞称为祖细胞progenitorcell。它没有自我更新能力。在经过几轮细胞分裂周期后产生的两个子代细胞均为终末分化细胞。干细胞根据分化潜能分类：1，全能干细胞：可以发育成一个完整个体的干细胞。受精卵在从输卵管向子宫运行的过程中不断地进行卵裂，当受精卵分裂8-16个细胞时为一实心球体称为桑椹胚。此时每个卵裂球仍保持全能性。将任意一个卵裂球放置到适当的子宫中，都可以发育成一个完整个体。2，三胚层多能干细胞：失去发育成完整个体的能力，但是仍具有向个体中任何一种细胞（包括生殖细胞）分化的潜能的干细胞，桑椹胚进入子宫后不久，分裂成由32-64个细胞组成的早期囊胚或胚泡，开始出现腔隙称为胚泡腔或囊胚腔。囊胚腔由一层细胞围成，这层细胞被称为滋养外胚，一端为内细胞团innercellmassICM。内细胞团细胞虽然失去了发育成完整个体的能力，但仍具有分化成个体中包括生殖细胞在内的各种细胞的潜能，因此属于三胚层多能干细胞。3，单胚层多能干细胞：只有向同一胚层细胞类型分化的干细胞。如间充质干细胞只能分化成成骨细胞，肌肉细胞，软骨细胞，脂肪细胞和其他结缔组织细胞，却不能分化成除此之外的其他组织细胞。4，单能干细胞：只能分化成一种细胞，如神经元干细胞只能分化成神经元而不能分化成星形胶质细胞或少突胶质细胞。根据来源分类:1，成体干细胞2，胎儿干细胞3，胚胎干细胞：通常源自囊胚内细胞团的胚胎干细胞，其高水平表达端粒酶。4，核移植干细胞：人类细胞中都包含一套人类完整的染色体，所有组织和器官的每个细胞中都含有一个人的全部基因。唯一不符合规律的是成熟的生殖细胞，它只含有其他细胞一半数目的染色体。克隆，即将细胞的核移植入一个去核的卵中，植入的核能引导整个细胞发育成完整的个体。这种技术最大的用途在于产生治疗人类疾病的干细胞，即治疗性克隆。这种核移植干细胞与成体具有的遗传信息完全相同，而且能够产生身体所有组织的替代细胞，相当于自体移植，避免了干细胞移植中的免疫排斥问题。在这项技术中，还可以利用基因替代技术矫正干细胞的遗传缺陷，进而用于治愈血友病，糖尿病等遗传性疾病。成体干细胞和胚胎干细胞区别：胚胎干来源清楚，多是来自囊胚的内细胞团或胎儿的生殖嵴，因此分离纯化都较易进行。成体干细胞数量少，就骨髓细胞来讲，每10000-15000个细胞中仅有1个是造血干细胞，再者很多成体干细胞人们尚未找到其特有的细胞表面标志，因此这些成体干细胞分离纯化相对困难。胚胎干细胞可无限增值而成体干细胞增值能力有限。胚胎干细胞要较成体干细胞分化潜能宽。胚胎干细胞有多能性，成体干细胞多为单胚层多能干细胞。胚胎干细胞可自动分化，将其植入免疫缺陷小鼠的皮下或肾囊肿，可形成畸胎瘤。胚胎干细胞可能引起免疫排斥反应。成体干细胞分化通常需要外界物质刺激，一般不会自动发生，避免免疫排斥反应。干细胞转分化：成体干细胞并未定型，一旦处于一个崭新的微环境中，它们将有可能分化为其他类型的细胞。干细胞临床应用前景：1，可直接采用干细胞移植，再生组织和再生器官2，用干细胞携带治疗基因，经诱导分化成成体细胞，用于治疗遗传性疾病3，利用细胞间的相互转化特性，用于自体组织和器官的修复，可以避免同种异体移植的免疫排斥反应。4，将干细胞作为种子细胞，与可降解支架材料联合培养，在体外构建有生命的种植体，修复组织缺陷或替代器官的一部分功能，治疗难治性疾病。5，建立干细胞库，用于将来自体病损组织或器官的修复，也可经配型后，用于同种异体组织或器官的修复。鉴别某种细胞是否是成体干细胞时，必须满足三个标准：1，在生物体内具有永久性的自我更新能力。2，形成克隆的能力。就是说单个成体干细胞是否能生成遗传性状一致的细胞群体，并且是否能够产生与其所在组织相同的完全分化细胞。3，能产生完全分化的细胞。完全分化的细胞应具有成熟的表型和特定的功能，而且能彻底整合到组织中。表型包括：能观察到的细胞所有的特性。外型（形态学）。与其他细胞和非细胞环境（细胞外基质）的相互作用。细胞的表面蛋白（表面标记）。细胞行为(如分泌，收缩，突触传递等)。成体干细胞的可塑性：1，横向分化：跨系分化2，去分化：产生一种更原始更多能的细胞，然后经过新的途径再分化为其他细胞。有尾目的两栖动物被截断肢体，尾巴，眼睛，或颌后，损伤边缘的成熟细胞通过去分化形成一个祖细胞群-胚基，然后激活再生程序，形成确实的肢体。不同组织的成体干细胞：一，骨髓干细胞HSC具有形成各种血液细胞的功能。骨髓中可能存在3种干细胞：造血干细胞，骨髓间充质干细胞，内皮祖细胞1，造血干细胞。未分化的HSC和造血祖细胞通常表达c-kit,CD34和H-2K,不表达或低表达Lin。通常用于移植的细胞为CD34+,Thy1+，Lin-。按增殖状态不同，将HSC分为两种：永久HSC和短暂HSC。2，骨髓间充质干细胞。CD71被认为是成熟间充质干细胞的标志，而作为造血干细胞典型的表面抗原的CD45,CD34和CD14则表现为阴性。二，神经干细胞：具有以下属性：不断增值分裂能力；自我维持和更新能力；多向分化的能力，分化为神经系统大部分类型细胞的能力；这种多分化潜能可以维持相当长时间，甚至终生。对损伤和疾病具有反应能力。自我更新和多分化潜能是神经干细胞的两个基本属性。神经干细胞是一类未成熟的细胞，它xuanzex地表达某些抗原标志，如nestin三，内皮干细胞：CD34+(一个HSC标志)，也表达GATA-2。四，骨骼肌干细胞。五，皮肤和消化系统的上皮祖细胞间充质干细胞1，种属差异对间充质干细胞生长的影响：BALB/c的CFU-F产量是C67B/b的10倍。计算培养的第8-18周的间充质干细胞的生长速率，发现BALB/c间充质干细胞的增长速率是FVB/N和DBA的10倍。2，培养条件和培养方法对间充质干细胞生长的影响:未经任何处理的塑料培养瓶培养的间充质干细胞的CFU-F的产量最高。而经Ⅰ型胶原，Ⅳ型胶原，层粘连蛋白，多聚赖氨酸和纤连蛋白处理的培养瓶培养的间充质干细胞中，层粘连蛋白处理的培养瓶CFU-F最低。3，接种细胞的密度对间充质干细胞生长的影响：人的骨髓间充质干细胞以0.5-12个/cm2不同的密度接种，每100个细胞形成的克隆数保持不变，但克隆大小随着接种密度的增加而显著减少，细胞产量也减少。4，取材对间充质干细胞的影响：脐带血的指控标准：脐带血从收集到分离的时间不超过15h，收集的血液不少于33ml，其中所含的单个核细胞数量超过1*1085，间充质干细胞的可塑性间充质干细胞的免疫学特性1，低免疫原性：间充质干细胞不表达MHC-Ⅱ类分子和FasL,不表达共刺激分子B7-1,B7-2,低水平表达或不表达MHC-Ⅰ类分子，CD40和CD40L。间充质干细胞的低免疫原性和较低的抗原提呈能力。2，免疫调节功能：对T淋巴细胞增殖的的抑制作用，间充质干细胞越多，抑制作用越强。骨髓间充质干细胞不诱导同种异体的淋巴细胞的增殖，而且它们可逃避被细胞毒性T淋巴细胞和同种异体反应的自然杀伤细胞的识别，不能被同种异体的细胞毒性T淋巴细胞或自然杀伤性细胞裂解。3，分化和未分化的间充质干细胞都不诱导同种异体T淋巴细胞的增殖反应，此外都具有调节免疫反应的能力。该结论支持间充质干细胞可在HLA不相容的个体之间移植的理论，为间充质干细胞的临床应用提供可靠依据。4，间充质干细胞在宿主体内存活并诱导免疫耐受：移植的间充质干细胞广泛分布在受着体内并存活。移植后的间充质干细胞迁移到胸腺发挥它们的免疫调节功能。间充质干细胞能分泌TGF-b1，该物质是IL-2和IL-4诱导T淋巴细胞增殖的抑制剂，还明显抑制CD3,CD4,CD8胸腺细胞的增殖。基质细胞系统还能通过提供必需的黏附位点在T淋巴细胞早期成熟中起作用。将小鼠的胸腺细胞铺到骨髓基质培养上显示不同的黏附敏感性，60%的双阴性T淋巴细胞（CD4-,CD8-）在培养过程中始终黏附在基质细胞上，双阳性T淋巴细胞只有22%是黏附的，没有单阳性细胞显示明显的黏附，提示骨髓基质可能作为T淋巴细胞胸腺外成熟的部位。推测间充质干细胞可能与保持淋巴细胞不成熟状态有关。神经干细胞生物学特性：1，自我更新；多向分化潜能，具有分化成有限细胞和构建组织的能力。可分化为神经元细胞，神经胶质细胞和少突胶质细胞。这三种细胞已成为鉴定神经干细胞分化能力的特异性指标。标志物：神经元特异性烯醇化酶NSE,胶质纤维酸性蛋白GFAP和小胶质细胞特异性抗原标志Gal-C阳性细胞。2，两种分裂方式：对称分裂生成两个干细胞或祖细胞，不对称分裂生成一个干细胞和一个祖细胞。3，神经干细胞的标志，神经干细胞是一类未成熟细胞，选择性的表达某些抗原标志如nestin巢蛋白。哺乳动物脑内的神经发生：神经干细胞的增殖，存活和分化的过程称为神经发生。胚胎发育过程中，最初位于脑室区，具有增值能力的神经干细胞逐渐定位于侧脑室的脑室下区SVZ。成年脑区神经干细胞主要局限在海马齿状回的颗粒区SGZ，纹状体和环绕侧脑室的室管膜下。海马DG区的神经发生随着年龄增长而降低。哺乳动物神经发生的调节：1，增值水平的调节：不同生长因子可在不