实验三槐花米黄酮苷元的提纯和鉴定

实验三槐花米黄酮苷元的提纯和鉴定槐米(SophoraeFlos)为豆科植物槐树(SophojaponicaL)的干燥花及花蕾.夏季花开放或花蕾形成时采收，及时干燥，除去枝、梗及杂质，前者习称”槐花”后者习称“槐米”[1]。历来用作止血药物治疗痔疮、子宫出血、吐血、鼻血等症。槐米用作药用已有2000多年历史，槐米中的主要化学成分是芦丁（亦称芸香苷Rutin），含量可高达23.5%。具有不可多得的治病防病作用，目前主要用于治疗毛细血管的脆性和渗透性出血，降低人体血脂和胆固醇，是治疗高血压心血管疾病胃病皮肤病糖尿病等多种疾病的良药;而且它还有抗菌和抗放射作用，可用于食品、化妆品的添加剂和着色剂；芦丁也用于药物的中间体，合成羟乙基芦丁等药物，可治疗闭塞性脑血管疾病[2]。Kite等[7]的研究显示，槐米中以槲皮素为苷元的黄酮化合物主要有4种，其中芦丁含量约占所有槲皮素苷的90%，是槐米中含量最高的黄酮苷成分.本实验的提取部分用超声提取新技术进行提取。一、主要黄酮类成分的物理性质1.芸香苷(Rutin)淡黄色针状结晶，熔点：含三分子结晶水物174~178℃，无水物为188℃。溶解度：溶剂溶解度%水MeOHEtOH吡啶冷0.00131.00.368.5热0.5511.23.5易溶不溶于乙醚、氯仿、石油醚、乙酸乙酯、丙酮等溶剂。易溶于碱液中呈黄色，酸化后复析出。可溶于浓硫酸呈棕黄色。加水稀释后又析出。2.槲皮素（quercetin）为黄色结晶。熔点：含2分子结晶水物313℃~314℃，无水物316℃。溶解度：乙醇：1：290，无水乙醇1：23（沸时）。可溶于甲醇、乙酸乙酯、丙酮、吡啶、冰醋酸。不溶于水、乙醚、苯、氯仿、石油醚等。二、实验目的1.了解超声提取的新技术；2.了解黄酮类化合物的一般性质；3.学习聚酰胺TCL法在黄酮类化合物中的应用；4.掌握有黄铜苷类水解制取黄铜苷元的方法。三、实验原理1.利用芦丁可溶于热水、难溶于冷水及易溶于碱水、难溶于酸水的性质进行提取。2.加石灰水的原因:黄酮类物质（除花色素外）因交叉共轭系统和苷上糖链的存在而具有一定的极性，但在水中较难溶解。大多数黄酮类物质具有酚羟基，因此可以用碱性水或碱性醇浸出，再经酸化而得。氢氧化钠水溶液的浸出能力高，但杂质较多，纯化不便。石灰水可以使一些鞣质或水溶性杂质沉淀生成钙盐沉淀，有利于浸液纯化。因此，本试验选择石灰乳调节3.加入硼砂的原因：碱性条件有利于提取率的提高,但芦丁分子中因含有邻二酚羟基,性质不太稳定,暴露于空气中缓缓分解变为暗褐色,在碱性条件下更容易被氧化分解,加入适量硼砂能将邻二酚羟基保护起来而有利于芦丁的提取,硼砂的加入量与提取物(槐米)的比例以0·025g~0·035g:1g为宜。4.超声提取法:通过液体介质引起的空化作用可造成植物细胞壁的瞬间破裂,便于提取溶剂渗透到植物细胞中,从而加速药材中有效成分的溶出,并且超声波提取不会改变有效成分的结构,同时减少溶媒用量、提高了提取效率，因而成为一种植物有效成分提取的新方法。魏彩霞等[3]在提取功率、超声提取时间、提取次数、料液比等单因素考察试验的基础上，通过正交设计进行三因素三水平试验。最佳超声辅助提取工艺条件为:超声频率20kHz，提取功率800W，提取温度60℃，料液比1∶20，超声提取2次，每次30min;芦丁提取率为18.25%，该提取工艺条件简单可行、速度快，可提高槐米中芦丁的产率。5.黄酮苷可通过酸水解，得到苷元及糖，并可通过TCL、PC及乙酰化物制备进行鉴识。6.本实验涉及的知识点：超声提取、重结晶、聚酰胺色谱、水解法测定苷的结构。四、实验试剂和仪器试剂：槐花米50g、蒸馏水、石灰乳、浓盐水、MeOH、100ml1%H2SO4、300ml甲醇、鼠李糖对照品、葡萄糖对照品、n-BuOH-HAc-H2O(4:1:5)上层液、苯胺-邻苯二甲酸盐试剂、芦丁对照品、槲皮素对照品、80%乙醇、浓氨水、1%AlCl3醇溶液、10%α-萘酚乙醇液、浓硫酸、镁粉、三氯化铁醇溶液、1%AlCl3乙醇溶液、1%醋酸镁甲醇溶液、2%ZrOCl2甲醇溶液、2%柠檬酸甲醇溶液，5%亚硝酸钠，10%硝酸铝，4.3%氢氧化钠。仪器：电子天平、研钵、500ml烧杯、100ml及10ml量筒、玻璃棒、pH试纸、超声清洗器、沸石、橡胶软管、水浴锅、抽滤漏斗、抽滤瓶、（红外灯）、250ml及500ml圆底烧瓶、球形冷凝管、电陶炉、旋转蒸发仪、分液漏斗、滤纸条、聚酰胺薄层板、展开槽、毛细管、紫外灯、小锥形瓶（或小试管）若干、紫外分光光度计。五．实验流程：六、实验方法1.芦丁的提取称取槐花米50g，研碎后置于1000ml的烧杯中，加热至70℃，加石灰乳调节pH10~11，加入硼砂1g[4]，浸润20min，然后超声提取30min（保持pH不变）,二次（第一次加水500ml，第二次加水450ml），合并滤液，在60~70℃下，用浓盐酸酸化至pH4~5，静置1h，减压过滤，取沉淀即得芦丁粗品。2.芦丁的精制上述沉淀称重后（湿品）加入25~30倍量的热水溶解，加热煮沸15min，趁热过滤，弃去不溶物，静置，放冷析出结晶、过滤，结晶自然干燥（或在红外灯下干燥、60~70℃），得芦丁水精制品。再取1g芦丁水精制品用MeOH重结晶（1:10~15）3.芦丁的水解称取芦丁水精制液1g，置250ml圆底烧瓶中加1%H2SO4100ml直火回流30min（注意观察现象）放冷过滤（滤液留作糖的检识）。沉淀物为芦丁苷元——槲皮素的粗品。用甲醇重结晶（槲皮素粗品水洗至中性，加250ml加甲醇，加热，放冷静置，抽滤得晶体）。干燥称重，得槲皮素精品。4.糖的检识取芦丁水解后的滤液20ml。加Ba(OH)2溶液（或固体BaCO3）中和至中性，不断搅拌下进行。滤去白色的BaSO4沉淀。滤液浓缩至2~3ml作纸色谱的样品溶液。条件：对照品：鼠李糖、葡萄糖展开剂：n-BuOH-HAc-H2O(4:1:5)上层液显色剂：苯胺-邻苯二甲酸盐试剂，喷后在105℃加热5-10min。5.芦丁及槲皮素的聚酰胺色谱样品：1%芦丁、槲皮素甲醇溶液对照品：芦丁、槲皮素对照品展开剂：80%乙醇显色方法：用浓氨水或1%AlCl3醇溶液显色后，日光及紫外灯下观察。6.芦丁及苷元的定性反应A样品制备：取芦丁及槲皮素精制品少许用MeOH溶解。B定性试验：取上述两试液1ml分别放于小试管中，按下列方法进行试验。比较苷与苷元的反应情况。莫氏(Molish)反应：加10%α-萘酚乙醇液1ml，振摇使之溶解，然后沿试管壁加浓硫酸约2ml，静置，观察，两液层界面变化，呈紫红色环者示分子中含糖结构。盐酸--镁粉反应：分别滴加浓盐酸，再各加镁粉少许，溶液由黄色逐渐变红者示有黄酮类化合物存在。三氯化铁反应：分别加三氯化铁醇溶液1~2滴，观察颜色。三氯化铝纸片反应：2条纸片上分别滴加芦丁、槲皮素后，各加1%AlCl3乙醇溶液2滴，紫外灯下观察荧光变化。醋酸镁纸片反应：取两张滤纸，分别滴两滴芦丁和槲皮素的甲醇溶液，然后各加1%醋酸镁甲醇溶液两滴，紫外灯下观察荧光的变化，并记录现象。锆盐—柠檬酸反应：分别加入2%ZrOCl2甲醇溶液3~4滴，观察颜色，然后加入2%柠檬酸甲醇溶液，观察颜色。7.芦丁的含量测定(1)对照品溶液的制备精密称取105干燥至恒重的芦丁对照品5mg，置50ml容量瓶中，用甲醇25ml溶解，蒸馏水定容至刻度，摇匀，即可。浓度为0.2mg/ml。(2)线性关系考察精密吸取对照品溶液0,4,8,12,16,20ml，置25ml容量瓶中，加蒸馏水至6ml，加5%亚硝酸钠1ml，摇匀，静置6min，加10%硝酸铝1ml，摇匀，静置6min，加4.3%氢氧化钠10ml，加蒸馏水至刻度，静置15min，用紫外分光光度计测定吸收度，检测波长510nm。以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，回归方程为：C=0.073A，相关系数为0.9996.表明浓度在0.008~0.018mg/ml范围内具有良好的线性关系。25ml容量瓶1（空白）234567（样品）芦丁对照品0.04.08.012.016.020.0样品液5.0ml5%亚硝酸钠1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml10%硝酸铝1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml4.3%氢氧化钠10ml10ml10ml10ml10ml10ml10ml用蒸馏水稀释至刻度摇匀，静置15minA(510nm)注意事项：1．芦丁粉碎的不可过细，一面过滤时速度过慢。2.本试验选择石灰乳调节，但pH值不能过高，否则钙能与芦丁形成螯合物而沉淀析出,pH过低会使芦丁形成（金羊）盐重新溶解，降低收率（最佳为4）3.利用芦丁在冷热水中的溶解地差别来达到重结晶的目的。七、主要参考文献上海药物研究所：中草药有效成分的提取和分离中国医学科学院药物研究所：中草药有效成分的研究（第一分册）药学杂志（日）72:333:195279:757:195976:1210:1956黄铜体化合鉴定手册。AmericanpharmaceuticalJournal41:585：1952中草药28：（2）：881997[1]国家药典委员会编中国药典[S]北京:化学工业出版社，2010:333.[2]胡杰，邓宇.芦丁提取工艺的综述[J]中国食品添加剂，2006(5):94-99.[3]魏彩霞，谢俊峰，高媛媛等.槐米中芦丁的超声辅助提取工艺研究〔J〕.制剂技术，2010，19(7):36-37.[4]萨燕平,彭永芳。超声辐射提取槐花米中的芦丁。云南化工[J],1996,(4):25~26。[5]唐爱莲,刘宁,程南秋.pH值对芦丁提取工艺影响及槲皮素制备工艺的研究.桂林医学院学报[J]11994,7(3):2932.[6]舒晓宏,冯梅,陈华,张宝,邓卅.槐花米中芦丁提取最佳pH值的实验研究[J].大连医科大学学报.2005(02)八、思考题1．为什么必须热水提取？水提取多用煎煮法而不用回流提取法，为什么？2．一般提取液需经适当浓缩才可析出结晶，为什么芦丁未经浓缩就析出结晶？3．一般需经分离净化才能得到化合物粗品，为什么芦丁未经这些处理就得到了粗品？4．酸水解常用什么酸，为什么用H2SO4比用HCl水解后处理更方便。5．为什么定性反应有的在试管中做，有的在纸片上做。6．当反应试剂组成是2个以上时，常需考虑试剂的加入顺序，试分析盐酸一镁粉反应。7．在本实验中各项检识（包括显色反应、降解反应、酰化反应等）的原理是什么？写出槲皮素降解反应的主要产物。8．本实验中各种层析原理是什么？解释化合物结构与Rf值的关系。9．黄酮类化合物有哪些提取方法？芦丁的提取还可以用什么方法？超声提取有何优点？