实验九卵母细胞的体外培养

实验九卵母细胞的体外成熟培养一、目的和要求随着哺乳动物体外受精、细胞核移植和外源基因导入、动物克隆等胚胎工程技术的快速发展,对卵母细胞的需求量日益增加。仅靠超数排卵技术已不能满足这类科研的需要。因此,屠宰场的卵巢成为了当前获得卵母细胞与胚胎的重要原材料、卵巢卵母细胞体外成熟获取大量的成熟卵母细胞。通过本实验要求掌握卵母细胞体外成熟培养的方法。二、材料和仪器设备二氧化碳培养箱、矿物油、丙酮酸钠、链霉素、青霉素、新生犊牛血清(NCS)、17β-E2、Hepes、实体显微镜、恒温水浴锅、M199培养液、生理盐水、捡卵器、灭菌吸水纸、5mL注射器、12号针头、PBSS、切割刀、8cm的培养皿、眼科剪、离心管等。三、操作步骤1.成熟培养液的制备：M199+10%NCS+1～2mg/L17β-E2+10mmol/LHepes+0.12mg/mL丙酮酸钠+双抗(0.1mg/mL链霉素和0.125mg/mL青霉素)。2.卵巢采集：兔子剖腹后,立即无菌采集卵巢,除去多余脂肪组织,灭菌吸水纸擦干,置于25～29℃或30～37℃灭菌生理盐水(添加少量抗菌素)中保存,6h以内送回实验室。3.卵巢表面卵泡(直径:2～6mm)卵母细胞的采集：30℃左右生理盐水洗卵巢3次后,用5mL注射器和12号针头及少量PBSS，先吸少量PBSS溶液,然后抽吸卵巢表面2～6mm卵泡,抽吸液注入灭菌的10mL离心管中,静置5min,弃上清液并镜检回收A、B级卵丘-卵母细胞复合体。4.机械破碎法收集卵母细胞：将采过表面卵泡的卵巢从门部纵切为两半,去除黄体、髓质和多余的脂肪组织,置于直径为8cm无菌的培养皿中,用眼科剪在表面皿内剪碎卵巢皮质(直径0.5mm)，之后,将碎组织置于另一培养皿进行冲洗和静置。如此反复三次,得四皿冲卵液,从中检出颗粒细胞一卵母细胞复合体。5.卵母细胞的筛选：将两种方法所得的卵泡液分别置于无菌的捡卵杯内,静置后在体视显微镜下捡卵。对捡出的卵丘卵母细胞复合体(COCS)在实体显微镜下按A、B、C三级标准分级、记数并记录采集时间。A,B级卵为体外培养可用卵。6.体外成熟培养(IVM)：选择A级或B级的卵母细胞,用成熟培养液洗涤3次后,移入CO2培养箱中预平衡2h后的50µL成熟培养液微滴（在直径为30mm的培养皿中,用体外成熟培养液制成3～4个微滴并覆盖矿物油,每个微滴中放入10～20枚COCS）。微滴培养条件为:5%CO2、39℃、饱和湿度,培养时间为24h。7.卵母细胞成熟的鉴定：卵母细胞的成熟是一个包括细胞核、细胞质、细胞膜、透明带等多方面在内的复杂生物学过程。在形态上表现为纺锤体形成,核仁致密化,染色质浓缩为染色体,第一极体的排出,卵丘/颗粒细胞的扩散、膨胀和透明带的软化等。本实验以卵丘细胞的扩散程度、第一极体的排出作为卵母细胞成熟的标志。四、作业简述实验过程和结果，根据结果进行分析。