康为世纪产品常见问题解决方案20110809

PCR产品无扩增条带：1.正对照样品或者内参基因引物均没有有效扩增1.1检测试验步骤、试剂、体系、程序是否正确。1.2相同模板，使用某公司产品可以有效扩增，而换用另一公司产品不能有效扩增1）不同产品，相同模板，但扩增条件存在差异，需要摸索试验条件，如降低退火温度，或增加模板浓度。2）一些产品对某些基因不适合扩增。解决方法：如使用mix没有有效扩增，给客户换成酶，或换成其他mix或者酶，尝试哪种产品最适合。2.正对照样品或者内参基因引物扩增，而实验样本没有有效扩增2.1反应体系：1）模板不纯或者有抑制物：建议纯化模板或将模板进行梯度稀释，以确定合适的浓度。2）引物扩增效率低：重新设计引物或者更换引物。2.2反应条件：解决方法：降低退火温度，增加延伸时间，增加循环次数。2.3需要扩增效率更高的酶或mix，建议使用增强型的EsTaqMasterMix，或GoldStarTaqMasterMix。非特异性扩增：有非特异性扩增条带或者有拖尾现象1.1反应体系：1）模板与引物浓度过高：降低模板或者引物量，降低dNTP浓度。2）模板纯度：纯化模板3）引物特异性：重新设计引物或者更换引物。1.2反应条件：解决方法：提高退火温度，降低延伸时间，降低循环次数。2.3需要特异性更高的酶或者mix，建议使用热启动酶和mix。GoldStarTaq和GoldStarBest琼脂糖凝胶检测正常，而使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后有背景条带。解决方案：给客户调换成无BSA的PCR酶或者mix。逆转录产品逆转录反应结束后，PCR检测：1.1PCR检测内参基因能够有效扩增，但目的基因不能有效扩增，说明逆转录正常，而目的基因的PCR扩增需要优化实验体系。1.2PCR检测内参基因和目的基因均不能有效扩增，需检测RNA质量和逆转录过程。检查RNA质量1.1电泳检测RNA完整性：28s和18s两条带，或同时有5s条带。无降解。1.2分光光度计或者nodrop检测RNA浓度和得率：对于SuperRT逆转录酶要求RNA的加入量为1ng-5ug。对于HiFi-MMLV逆转录酶要求RNA的加入量为10ng-5ug。逆转录：1.1检测RT反应液加入到PCR或Real-timePCR的体积是否过高。将得到的RT反应液（cDNA溶液），其加入量不要超过PCR反应体积的10%。1.2逆转录反应体系和程序建议首先按照说明书上的第一种逆转录操作步骤进行，即42℃孵育50分钟，70℃孵育15分钟。1.3如果逆转录效率低，表现为RNA质量符合以上要求，内参基因不能正常扩增目的条带。1）建议使用第二种逆转录操作步骤。即70℃孵育10分钟，迅速冰浴2分钟。再加入逆转录酶，42℃孵育50分钟。70℃孵育15分钟。2）建议使用高端产品SuperRT逆转录酶，对低拷贝的模板逆转录效率更高。1.4若RNA量小于50ng，建议加入RNA酶抑制剂。1.5逆转录酶的储存，是否有反复冻融的情况。2.试剂量不够：2.1产品管壁或者管口有液体。2.2移液器不准，或者枪头溶液挂壁严重。解决方案：客户拿到产品后，应在冰上融解，并短暂离心后，再使用。荧光定量产品扩增曲线内参基因和目的基因均无CT值（信号）出现或CT值出现过晚1.检测试验步骤、试剂、体系、程序是否正确。注意：UltraSYBRMixture：热启动95度，10分钟FastSYBRMixture：热启动95度，20秒与宝生物等其他公司产品的热启动时间不同，因此建议严格按照说明书体系操作。2.模板中含有抑制剂、核酸酶、蛋白酶等。不建议使用原液进行荧光定量，应将模板原液进行稀释后操作。如5倍的梯度稀释，以确定最佳的样本浓度。3.确定模板的提取质量，模板是否出现降解。4.模板量不足，将模板进行梯度稀释，如5倍的梯度稀释，以确定最佳的样本浓度。内参基因Ct值出现正常，但目的基因Ct值较晚出现。1.内参基因能有效扩增，说明荧光定量试剂没有问题。2.目的基因ct值出现较晚，可能原因为：1）目的基因表达量偏低2）目的基因引物扩增效率低解决方法：将模板进行梯度稀释，如5倍的梯度稀释，以确定引物的扩增效率。引物扩增效率建议在90%-110%左右。或更换引物，或重新设计引物。PCR电泳有结果，但是荧光定量PCR没有扩增曲线和融解曲线。2.1检测试验步骤、试剂、体系、程序是否正确。2.2定量PCR和普通PCR有时会出现结果不一致的现象。若可以重复出荧光定量PCR的结果，结果稳定，建议继续使用荧光定量PCR结果。熔解曲线不止一个主峰1.1若在熔解曲线主峰前面出现小峰，并且小峰的Tm值在70-80范围内，很可能是引物二聚体。同时查找阴性对照。解决方法：1）降低引物浓度2）提高退火温度1.2阴性对照有污染。需检查试剂、移液器、操作台等。1.3模板有基因组的污染。解决方法：RNA提取过程中避免DNA的引入，建议将RNA用DNaseⅠ消化，或通过跨内含子设计引物避免基因组污染。1.4高浓度样本熔解曲线正常，低浓度样本出现双峰或多峰。在低浓度样本中，模板拷贝数低，因此会出现引物二聚体的现象。