实验六维生素E的含量测定-液相色谱

实验六高效液相色谱法分离和测定α-ＶE一、实验目的1.了解高效液相色谱仪的基本结构，掌握液相色谱仪的基本操作方法。2.掌握液相色谱分析的定性及外标定量方法。二、原理1.高效液相色谱的特点高压泵输送流动相，梯度洗脱，可在柱后直接检测流出液成分，通过改变溶剂极性或强度进而改变色谱柱效能，分离选择性和组分的容量因子，实现改善色谱系统分离度的目的。2.高效液相色谱仪(1)高压输液系统，是提供足够恒定的高压，使流动相以稳定的流量快速渗透通过固定相。(2)进样系统，一般采用旋转式六通阀在高压下进样。(3)分离系统，在液相色谱柱中完成。(4)检测系统，液相色谱常见检测器有：紫外光度检测器，示差折光检测器、荧光检测器电化学检测器。3.高效液相色谱的类型根据固定相和分离机理的不同，高效液相色谱如下几种类型(1)液—固吸附色谱：基于各组分在固体吸附剂表面上具有不同吸附能力而进行分离。(2)液—液分配色谱：组分在两相间经过反复多次分配各组分间产生差速迁移，从而实现分离。(3)化学键合相色谱：通过共价键将有机固定液结合到硅胶载体表面得到各种性能的固定相。(4)离子交换色谱：离子交换树脂上可电离的离子与流动相中带相同电荷的组分离子进行可逆交换，由于亲和力的不同彼此分离。(5)离子色谱：用离交换树酯作为固定相，电解质溶液为流动相，用电导检测器检测。(6)凝胶色谱：基于试样中各组分分子的大小和形状不同来实现分离。4.实验原理反向色谱与正相色谱组成相反，是以非极性或弱极性的固定液制成的固定相，以极性或相对强的极性溶剂作为流动相组成的液—液分配色谱。但目前多是采用化学反应的方法将非极性或弱极性的有机物分子键合到载体表面，制成键合相的固定相，所以也称键合相色谱。这种色谱的分离机理比较复杂，一般认为是液—固吸附和液—液分配并存。在反向HPLC中常用的键合相有十八烷基硅烷(Ｃ18）、辛基硅烷(Ｃ8)氰基硅烷、氨基硅烷等。常用的溶剂有甲醇，乙腈、水等。有时需要加入某种修饰剂以获得良好的分离。例如利用反相键合相色谱分离弱酸时为了抑制它的解离，须在乙腈/水或甲醇/水流动相中加入少量的乙酸。三、仪器与试剂1.仪器北京普析L600高效液相色谱仪（包括高压输液泵、进样阀及紫外检测器）；色谱数据处理软件；50µL液相色谱微量注射器。2.试剂水（双蒸水）；甲醇(色谱纯分析纯均可)。3.样品维生素E标准品（CAS：7695-91-2）维生素E粉样品浓度配置成1g/L4.实验条件色谱固定相：C8键合多孔硅胶微球（或C18键合多孔硅胶微球），5µm。色谱柱：150mm×4.6mmI.D.。流动相：甲醇-水（97:3）流动相流速：1mL/min。柱温：30℃。检测波长：292nm。进样量：20µL。四、实验步骤1.色谱操作条件设定按照操作要求，打开计算机及色谱仪各部分电源开关。打开色谱在线操作软件“Instrumentonline”，在“methodandruncontrol”界面下，设置操作条件，包括流动相组成、流量、分析时间、柱温及检测波长。2.色谱分析待色谱基线平直后，从“runcontrol”菜单中，选择“sampleinfo”，设置数据文件名，用微量进样器吸取20µL样品溶液，通过进样阀进样，每一次色谱测定完成后，数据被保存在设定的文件中。五、实验数据及结果1.标准品保留时间对照法定性从“view”菜单中选择“dataanalysis”，进入数据分析界面。用“loadsignal”指令打开数据文件，将测定的各个单组份样品色谱图中的保留时间与混合物样品中的色谱峰保留时间对照，确定混合物色谱中不同时间的色谱峰属于何种组份。2.天然维生素E样品中α-ＶE的定量分析（外标两点法）(1)建立标准曲线。首先用两种不同浓度的混合物标准溶液的色谱结果建立标准曲线。从“calibration”菜单中选择“calibrationsetting”，输入浓度单位、时间窗口和校正曲线类型（曲线类型选择“linear”）。用“loadsignal”调出标准溶液1的色谱数据文件。从“calibration”菜单中选择“newcalibrationtable”,并在显示的窗口中输入“1”作为校正级数（level），在校正表中输入各组分名称及浓度值。用“loadsignal”调出标准溶液2的色谱数据文件。点击“addlevel”，输入校正级数“2”（level2），在校正表中输入标准溶液2中的浓度值。所得到的各组分的校正曲线（标准曲线）自动显示于右侧窗口，所得到的校正因子也会显示于校正表中。(2)待测样品浓度计算及结果打印。在建立标准曲线后，用外标法进行待测样品溶液中各组分浓度的计算。用峰面积进行定量。用“loadsignal”打开待测样品色谱数据文件，在“report”菜单中选择“specifyreport”，在“quantitativeresultcalculation”一栏中选择“ESTD”（外标法）作为定量方法。在“basedon”一栏中选择“area”（峰面积）。在“report”菜单中选择“printreport”，数据处理系统自动根据校正曲线计算出待测样品各组分的含量并将报告显示在计算机屏幕上。在报告下方选择“print”，打印出数据报告。(3)在实验报告中以表格形式列出各组分的名称、保留时间、待测样品测得浓度，计算相对误差（相对误差以配制浓度作为实际浓度计算），附上色谱图。六、注意事项1.紫外检测器灵敏度较高，所以样品应该保持合理的浓度，标准样品的浓度为1g/L，未知样品浓度和已知样品浓度不要相差太大。2.选择最佳色谱条件时既要注意分离度又要考虑到分析时间，尽量做到高效，高速，高灵敏度。七、思考题1.在使用外标法定量时，哪些因素可能导致测定误差？2.以标准品保留时间对照法对混合物各色谱峰进行定性是否在任何情况下都适用？参考图谱：