实验设计-外显子的捕捉与鉴定

外显子的捕捉与鉴定一、实验目的通过本实验了解外显子捕捉的实验原理，掌握外显子捕捉和采用DNA探针检测特定DNA片段的遗传分析方法。二、实验原理1.真核生物的基因结构不同于原核生物，真核生物基因的编码序列是不连贯的，即在两个编码序列之间有一段不编码蛋白质的非编码序列。编码序列称为外显子（exon），非编码序列称为内含子（intron）。两个外显子之间插入了一个内含子。外显子是出现在mRNA分子中的基因序列；内含子则是不出现在mRNA分子中的基因序列。2.外显子捕捉“外显子捕捉(exontrapping)”曾称exonamplification,是从基因组克隆片段中分离可表达序列的技术之一，在“人类基因组计划”中得到了广泛的应用，是通过构建一种载体，从其插入片段中识别和回收外显子序列的实验方法。捕捉外显子的载体pETV-SD是一种反转录病毒穿梭载体（shuttlevector），即其可在不同种的生物中如大肠杆菌和酵母中，细菌和哺乳动物细胞中进行复制的载体。因为凡是含有内含子和外显子的基因在转录后都要经过RNA剪接，这就需要有剪接供体（splicingdonor，SD）位点和剪接受体（splicingacceptor，SA）位点。因此，SA位点可作为基因的标志。pETV-SD载体的片段中含有无SA的位点。它含有β珠蛋白(HBG)基因的第1个外显子、其有功能的SD位点、该基因的间隔序列（IVS）和α，β-半乳糖苷酶（α，β-GAL）基因。3.原位杂交（insituhybridization）定位原位杂交是将待定基因的特定DNA序列或该基因转录产生的RNA分子作为探针，在标记了放射性同位素或非放射性化学物质后与变性后的染色体DNA杂交，该探针就会同染色体DNA中与其互补的序列结合成为双链，通过放射自显影技术或显色技术，就可显示标记了放射性同位素或非放射性化学物质的探针的位置，达到基因定位的目的。用放射性化学物质如荧光素标记探针后，则在荧光显微镜下，探针所在的位置上可呈现出荧光，这称为荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization，FISH）。4.操作步骤及基本原理如下：（1）提取细胞核中的基因组DNA；（2）特定的限制性内切酶切割真核基因组DNA，获得所要检测的DNA小片段；（3）将获得的DNA小片段克隆在位于“外显子捕捉序列”下游的克隆位点上；（4）将获得的重组载体感染反转录病毒的专宿包装细胞系（ecotropicretroviralpackagingcellline）——ψ2细胞系。ψ2细胞提供蛋白质产物使载体（自身不能合成病毒蛋白质）成为反转录病毒在细胞里增殖。当反转录病毒在细胞内转录时，插入的DNA片段中包含有功能的SA位点，会发生RNA剪接反应而将IVS切除；（5）ψ2细胞培养液中含有包装了已剪接和未剪接病毒RNA的病毒子（virion），用来感染组成型产生SV40T（肿瘤）抗原的COS细胞。病毒RNA基因组被反转录，并在载体上的SV40复制起点作用下，以环状DNA附加体形式进行复制。（6）从COS细胞中回收复制的附加体DNA，经限制性内切酶DpnⅠ酶切后转化细菌。在含卡那霉素（Kn）和5-氯-4溴-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）的培养基上挑选转化子。β-半乳糖苷酶可水解X-gal而生成蓝色产物，不产生β-半乳糖苷酶的转化子菌落则呈白色。（7）只挑选白色菌落作进一步研究的材料。白色菌落的生成可以有两种原因。一是由于基因发生突变，使β-半乳糖苷酶失去活性；二是由于在反转录病毒生活周期的RNA时期中发生了剪接反应，从而丢失了α，β-半乳糖苷酶基因。（8）如果是真正发生了RNA剪接事件，准确的剪接反应可切除作为标记的IVS，使人β珠蛋白基因的第1外显子与落入了捕捉陷阱的插入片段中的外显子序列直接连接；（9）从白色菌落制成的菌液中分离载体，采用可以和该段外显子特定核酸序列互补的DNA探针进行原位杂交，可以鉴别该菌落是否是由捕获了外显子的转化子形成的。三、实验材料毕赤酵母菌、pETV-SD载体、限制性内切酶A、DNA连接酶、ψ2细胞系、组成型产生SV40T（肿瘤）抗原COS细胞系、限制性内切酶DpnⅠ酶、大肠杆菌四、实验用品和试剂五、实验步骤1.毕赤酵母基因组DNA的提取（1）接种重组和空质粒转化子于5mlYPDZ培养基，GS115菌于YPD培养基作对照，30℃培养16～18小时。（2）室温下，1500g离心5-10min收集菌体。（3）100ulTE（pH7.0）重悬，加入300ulEDTA（pH8.0），0.07MTris-HCl，3ulβ-巯基乙醇，1ulLyticase，37℃水浴30min。（4）10000g离心5~10min，取沉淀，加90ulTE重悬。（5）200ul饱和酚，200ul氯仿，混匀，离心30s，取上层水相。（6）加入两倍体积无水乙醇以及1/10体积的NaAC，-20℃放置30min。（7）10000g离心20min，弃上清；75%乙醇漂洗沉淀一次。（8）干燥后，加入15µl的TE或H2O溶解，-20℃备用。2.特定DNA片段的获得和重组（1）将限制性内切酶A加入载体pETV-SD溶液中，从克隆位点处切开pETV-SD载体，使其开环并形成特定的粘性末端。（2）将限制性内切酶A加入上一步获得的酵母基因组DNA中，获得特定小片段的DNA，该小片段DNA和上述载体具有相同的粘性末端。（3）分别纯化上述两种溶液，获得开环的载体溶液和小片段DNA溶液，并将小片段DNA溶液分成两份，一份用于基因重组，另一份用于DNA探针的制备。（4）将第三步中的载体溶液和其中一份小片段DNA溶液混合，加入DNA连接酶和特定的缓冲溶液，使其进行连接反应，获得重组载体。3.DNA探针的制备（1）取步骤2.（3）中的另一份小片段DNA溶液来制备探针，制成缺口平移反应体系。（2）在适当的反应条件下进行缺口平移反应。（3）凝胶电泳判断探针大小，如片段大小偏大，则于延长反应10～30分钟，再重复进行凝胶电泳，直至得到合适大小的探针。（4）向反应体系中加入1μl0.5MEDTA和（或）70℃加热5分钟，以灭活酶，终止反应，制得的探针于-20℃保存备用。4.外显子捕获（1）将步骤2.所获得的重组载体溶液加入ψ2细胞系培养皿中进行感染；（2）37℃培养2-3天，将所得的ψ2细胞系培养液加入组成型产生SV40T（肿瘤）抗原的COS细胞培养皿中进行克隆，37℃再培养2天；（3）从COS细胞培养液中分离复制得到的重组载体DNA；（4）向上述重组载体溶液中加入限制性内切酶DpnⅠ进行酶切；（5）酶切后的溶液加入大肠杆菌菌液当中，转化细菌；（6）把转化反应完成后的菌液涂布在含卡那霉素（Kn）和5-氯-4溴-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）的肉汤培养基上；（7）培养2天之后观察结果。（8）在上述培养基上长出的蓝色菌落附近挑取三个白色菌落，分别制成相应的三份菌液；（9）进一步将菌液制成玻片样本。5.荧光原位杂交鉴定捕获的外显子（1）将步骤3.中制得的探针在75℃恒温水浴中温育5min，立即置0℃，5～10min，使双链DNA探针变性。（2）采用烘烤玻片和加变性液的方式使步骤4.（9）中制得的载体DNA分子变性。（3）将已变性或预退火的DNA探针10μL滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上盖玻片，用Parafilm封片，置于潮湿暗盒中37℃杂交过夜（约15～17h）。（4）洗脱，除去非特异性结合的探针。（5）杂交信号的放大。（6）封片。（7）荧光显微镜观察FISH结果。六、试验结果（预期）1.外显子捕获步骤中用载体转化大肠杆菌培养结果肉汤培养基上出现蓝色和白色两种菌落，如下图所示：2.荧光原位杂交鉴定结果在荧光显微镜下，可以看到制成的玻片当中有荧光探针发出荧光，如下图所示：注：也有可能三个片子中只有其中一个或两个当中能看到探针，甚至三个都没有。七．讨论分析1.实验材料的选择（1）用于制备被捕获外显子的真核生物首先应该优先考虑模式生物，因为模式生物的基因组的序列信息和各个基因的结构和功能基本上都是清楚的，在后续过程中会对其基因组进行限制性内切酶的剪切，以获得可以捕获的外显子，因而对切下来的这小段DNA有两个最基本的要求：一是必须在两边有相同的且是特异的限制性内切酶位点，可以经过两端切割后脱离基因组DNA形成小片段，而其他部分的DNA片段不会被切下来；二是这段基因中必须含有剪接受体（splicingacceptor，SA）位点，否则也无法发生剪接反应，得不到后续的实验结果。（2）限制性内切酶A限制性内切酶A中的“A”只是一个代号，因为还没有确定，它的选择应该基于上述小片段DNA的特点，就是说这种限制性内切酶能够特异性识别该种小片段DNA两边的核酸序列，把它从基因组DNA中切出来，而不会切割其他部分。（3）对载体的要求对载体的说明在前面的原理部分阐述得比较多了，特别要说明的一点就是对它克隆位点的要求，必须要有能被限制性内切酶A切割的克隆位点，不过这个要求应该不难达到，因为也可以用人工合成被限制性内切酶A切割的多克隆位点结合上去，已最终形成和小片段DNA相同的粘性末端。2.实验步骤的选择（1）在理论课本对外显子捕获原理的叙述中其实还有一项，但在这个实验设计中被省去了，这一步是在用重组载体感染ψ2细胞系得到细胞培养液，收集其中含已剪接和未剪接的病毒RNA的病毒子（virion），并用来感染兼宿反转录病毒包装细胞系（amphotropicretrobiralpackagingcellline）PA-317。这使反转录病毒再进行一轮复制，并产生能感染猴肾细胞系COS细胞的高效价病毒原种。这样做是由于上一轮克隆在病毒中的插入片段的剪接效率极低，而在第二轮复制时则大大提高了RNA剪接的机会。但我主要是出于以下的原因去掉了这一步：课本中的原理讲的是外显子捕捉在“人类基因组计划”中的应用，那么其前提是所要捕获的外显子是通过“霰弹法”切成的很多未知的基因组DNA片段，在这种前提之下，首先能与载体结合的DNA片段只占一部分，与载体结合后结构完整的特别是含有剪接受体位点的又只占一小部分，所以在第一轮克隆中剪接效率极低，但在本实验中，要插入的是已知特定的DNA序列，它能顺利结合在载体上并具有剪接受体位点，因此只要连接上去就能剪接，所以应该是能保证只进行一轮就获得较高的剪接效率的。（2）在获得蓝白菌落后，直接将制得的菌液制片，然后进行荧光原位杂交鉴定，而不是先从菌液中提取载体DNA再进行荧光原位杂交鉴定，这一步的简略主要是出于简化实验步骤的考虑，而两个不同步骤得出的结果应该是一致的，即还是捕获了外显子的载体发荧光，没有捕获外显子的载体不发荧光。（3）获得蓝白菌落后挑取的白色菌落数目暂定为三个，但其实可能三个片子不够，因为白色菌落的出现很有可能是突变的结果，探针不能杂交，没有荧光出现，如果这种情况发生的概率比较大的话，那么就需要增加挑取菌落的数量。（4）在用限制性内切酶A切割分别获得载体DNA和小片段DNA之后增加了一个分离提纯的步骤，将限制性内切酶A除去，分别获得单独的载体DNA溶液和小片段DNA溶液，将其混合后再加连接酶进行连接反应。但其实这几个步骤可以在同一个体系中一次性发生，即直接把载体和基因组DNA，以及限制性内切酶A这三种材料加在一起反应，等反应较完全的时候，加入特定的失活剂使限制性内切酶A失活，停止切割，然后直接加链接酶进行进一步的连接反应，但主要是出于这几个原因我还是没有简化：a)这两个体系是否可以这样“混用”；b)连接酶能否在使限制性内切酶A失活的条件下自身却保持较高的催化活性；c)限制性内切酶A能否完全失活，会不会把它留在体系中，它会继续作用，切割连接好的重组DNA分子。（5）在本实验中，DNA探针是以第一步提取到的小片段DNA为模板的制备的，如前所述，如果我们对该段DNA小片段的序列了解得比较清楚的话，也可以直接人工合成。3.实验注意事项（1）将ψ2细胞系培养液加入组成型产生SV40T（肿瘤）抗原的COS细胞培养皿中时应