异种肾移植的研究现状与展望

1异种肾移植的研究现状与展望燕翔丁强目前随着同种肾移植的不断成功，肾源缺乏越来越成为迫切需要解决的问题,异种肾移植（xeno-renaltransplantatiom,XRT）成为克服人类肾源不足的根本途径之一[1]。法国的一项调查表明：虽然异种移植会带来复杂的社会与伦理问题，但更多的人支持异种移植[2]。各国学者纷纷投入这方面的研究,1997年中国国家自然科学基金委员会将猪/人异种移植基础研究列为重大攻关项目。然而异种移植带来的各种排斥反应成为限制其临床应用的主要障碍，随着分子生物学及免疫学的飞速发展，异种移植所面临的难题正逐步被克服。一．异种器官来源的选择尽管灵长类动物与人的血缘相近，但它们绝非人类理想的器官捐献者，因为它们常带有对人类易感的病毒，且繁殖周期长，来源困难，更受到高智力动物保护及伦理问题的困扰[3]。相比之下，猪似乎是最佳的选择，它们携带的病原体易控制，且易饲养、繁殖快，并且人类宰食猪历史悠久，全无心理与伦理障碍;更重要的是，猪肾的大小、重量、解剖结构、生理指标与人类接近，它的多乳头肾与人肾有相似的肾小球滤过率、总肾血流量和浓缩能力，血清中电解质浓度和酸碱度也与人相似，猪肾中还有1--羟化酶活性，可以像人一样代谢VitD[4]。二.异种肾移植的排斥反应（一）超急性排斥反应（hyperacuterejection,HAR）普通的猪肾移植给人类，受者体内预存的反应性天然抗体（xenogenicnaturalantibody,XNA)与猪肾的异种抗原特异结合造成移植肾立即发生不可逆的病理损害，移植肾在数分钟至数十分钟即失活，被认为是异种肾移植的主要障碍。HAR过程有补体参与，补体激活途径既有经典途径,也有替代途径,而主要是通过经典途径激活的[5]。1,3半乳糖(-Gal)是主要的异种抗原,它是通过1,3半乳糖转移酶(-GT)催化生成的,只存在于非灵长类哺乳动物及新世纪猴的细胞表面，人类、类人猿及旧世纪猴细胞表面无-Gal[6]。Platt等[7]报道猪的血管内皮细胞上有很多糖蛋白带有-Gal表位，其中3种糖蛋白序列与人的整合素相似。XNA是受体血清中针对异种抗原的天然抗体,早期研究多认为这种抗体主要是IgG类抗体，目前认为还有IgM类抗体参与HAR,且在最初是由IgM类抗体介导，IgG类抗体则更可能与单核细胞浸润移植物，与HAR之后的排斥反应有关[8]。异种抗原与XNA结合之后激活补体系统，形成膜攻击单位（MAC），破坏异种组织;而补体激活后进一步激活血管内皮细胞（EC），形成微循环广泛微血栓，则是HAR的主要损伤过程[9，10]。细胞免疫在HAR中常被忽视，Davis等[11]研究表明在没有补体作用的情况下，中性粒细胞在HAR中发挥着重要作用。另外，淋巴细胞和自然杀伤细胞（NK）也参与HAR。目前认为在HAR中细胞免疫反应主要是继续反应，其中CD4+细胞与排斥反应密切相关，抑制中性粒细胞以及抗CD4+抗体的应用可延长移植物的存活。（二）迟发型异种移植排斥反应（drlayedxenotransplantationrejection,DXR）若HAR被阻止，但将面临DXR，也称急性血管排斥反应。其定义：异种移植器官血管内皮细胞（EC）激活的持续状态，通过诱导促凝血因子，细胞因子和细胞粘附分子，导致排斥反应，其表现与HAR相同。DXR的机制尚不完全清楚，普遍认为可能是XNA与-Gal结合后，形成MAC，引起IL-1释放和持续性EC激活，导致DXR的变化，XNA与EC表面的-Gal结合后甚至可以直接诱发血管收缩和缺血[12]。Shoskes等[13]认为异种移植种异种MHC抗原可能主要通过间接提呈的方式激活T细胞，有别于同种移植的排斥反应。DXR是导致异种移植器官不能长期存活的重要原因，已受到越来越多的关注。2（三）慢性排斥反应异种移植的慢性排斥反应研究很少，同样也是同种移植难以克服的困难。多方面研究表明，与慢性排斥反应有关的高危因素有：组织不相容性、延迟移植肾恢复功能、急性排斥反应的类型、发生时间与次数、CMV感染、病理性脂质代谢异常等。三.排斥反应的对策目前临床上尚无有效治疗慢性排斥反应的药物，预防HAR对异种肾移植有着重要的意义，可以使垂危而又缺乏人肾供体的病人多活数周或数月，以坚持到获得同种移植的机会[3]。目前围绕如何克服HAR的研究取得了令人鼓舞的成就，主要是从受体与供体两个方面出发。（一）针对受体的策略1.去除或封闭天然抗体当受体暂时缺少XNA时可不发生排斥，这一现象称之为“适应”。目前研究的方法有两类，一类是用-Gal构建免疫吸附柱，用来吸附受体血清中的XNA。有人将受体血浆经体外灌注猪的器官后，再回输给受体，可以去除受体血清中XNA，且血浆灌注较血液灌注安全[6]。另一类研究比较多，即含有-Gal位点的抗原封闭受体XNA，此类抗原有蜜二糖、阿拉伯半乳糖以及从猪胃粘蛋白中分离出的中性聚糖和O聚糖[15]，还有Kooyman等[16]人工合成的多肽（SSLRGF）以及Liu等[18]合成的粘蛋白/免疫球蛋白等。这些抗原能在一定程度上减轻或暂时避免AHR，但所有的免疫吸附措施都不可能彻底杜绝XNA在血清中再次出现。有人用基因工程的方法，将编码-GT的cDNA转染细胞，使细胞表达-Gal,用这种细胞来封闭XNA。Koren等[18]用人抗-Gal抗体免疫小鼠获鼠单克隆抗独特型抗体（AIAS），AIAS可特异性结合受体XNA，并直接结合在表面有相同独特型的BLC亚群，不仅能中和XNA，并能抑制这类抗体产生，但尚需要更多的体内实验依据。2.应用补体抑制剂由于补体直接参与HAR，故抑制补体活性更有直接的意义。这类抑制剂有：C1抑制物、可容性补体受体1（ScR1）、眼镜蛇毒因子（CVF）等。有人在异种肺移植模型（仓鼠/大鼠）中发现环孢霉素A（CyA）有效地抑制了C3在靶细胞上的沉积，提示外源性药物中止补体活性为抑制HAR提供了方向。Flane等[19]在猪肾/人血液体外灌注实验中，应用静脉免疫球蛋白（IVIG）明显减弱了补体的活性，延长了猪肾的存活期（灌注时用了IVIG的猪肾存活期为6.5h，显著高于对照组3.5h）；另外IVIG还有多种免疫抑制作用，如阻断Fc受体功能、下调抗体生成、减弱细胞毒作用及炎症介质生成。3.减少活性因子的损伤Cruzado等[20]在研究猪肾/人血液体外灌注时发现血小板活化因子（PAF）明显升高，对HAR的急性炎症反应及微血栓形成可能有重要意义，用BM52021（一种PAF受体拮抗剂）可减轻HAR的病理表现。4.应用免疫抑制免疫抑制剂可以抑制受者免疫系统，减轻包括HAR在内的排斥反应，延长异种移植肾的存活期。王熹[21，22]等建立了豚鼠/大白鼠异种肾移植模型，并用HWA486（一种新型免疫抑制剂）经胃管给药，用药7d后，泌尿时间达(27.257.63)min,没用药的对照组为(6.580.64min),提示此种免疫抑制剂对HAR有一定抑制作用,但不能避免其发生。还有一些新型免疫抑制剂，如FK506、霉酚酸、雷帕霉素等的效果也令人振奋,但长期应用任何一种免疫抑制剂都会对受体产生负面影响,即感染、肿瘤以及对移植肾的慢性损伤.5.诱导免疫耐受当免疫抑制措施不力时,引入免疫耐受甚为重要,有三种措施:生成混合性造血微嵌合体;建立微嵌合体以及胸腺移植；建立周围耐受性,有阻断共同刺激的方法,即注入可溶3性CTLA-4T细胞分子和CTLA-4-Ig免疫球蛋白的融合蛋白。二.针对供体的策略用1.消除或抑制异种抗原用酶处理法可暂时消除供体细胞表面的异种抗原。沈文律等研究表明半乳糖酶可有效的消除猪血管EC表面的-Gal，同时血管结构保持完整,但如何用此酶处理猪的肾脏以及效果如何尚待研究。在基因水平改造-Gal是消除-Gal的根本方法，-Gal的表达需要半乳糖基转移酶(-GT)的正常表达，可以采用反义技术干扰-GT的表达从而干扰-Gal的表达。Strahan等[23]用-GT的mRNA的反义寡核苷酸抑制了体外培养的猪血管内皮细胞-Gal的合成，但-Gal仅减少40%；Keams等[24]采用反义技术来干扰猪血管内皮-Gal的表达，其中被XNAIgM识别的GpⅢa(一种整合素)下降20%-35%，被IgG识别的下降32%。Tearle等[25]采用基因工程的方法将编码小鼠-GT的基因敲除，从而获得不表达-Gal的小鼠，但敲除猪-GT基因的实验尚未成功。已经明确编码猪-GT的基因位于猪一号染色体长臂10带~11带，编码371个氨基酸组成的蛋白。Vahove等[10]用构建的抗猪-GT的单链Fv抗体cDNA体外转染猪的细胞得到sFv抗体，用免疫荧光法测得-GT活性减小70%，进而使-Gal的表达减低至同样程度，异种抗原与天然抗体的结合程度则减低90%，开辟了抑制-Gal的新天地。然而，即便-Gal被完全消除，仍可能有其他非-Gal抗原在异种移植排斥反应中成为攻击对象，亦可能在正常情况下它们为隐匿抗原，在-Gal被去除后才成为主要靶抗原。已报道涎酰化的Tn和Fossman抗原，猪组织表达的人血型抗原A，TNF诱导猪动脉血管内皮细胞（PAEC）表达的gp65和gp100,可能是除-Gal以外的异种抗原。Naziruddin等[26]研究表明抗HLA独特型抗体与猪MHC分子（SLA）可有交叉反应性，提示SLA也是异种抗原之一。2.改造供体免疫系统用基因工程的方法修饰供体基因，使之具备人类免疫系统，异种移植后受体的免疫系统不再将异种器官视为“非己”。这方面的研究焦点是让异种细胞表达人细胞膜上的补体调节蛋白，这类蛋白有膜辅因子蛋白（MCP，CD46）、衰变加速因子（DAF，CD55）、C8结合蛋白（C8bp）、CD59、H因子、I因子等，它们可以阻断补体激活途径。自从剑桥大学首次将人体CD55基因转入猪细胞以来，陆续有转hDAF及hCD59基因猪培育成功的报道[27，28]。多项研究表明几种调节因子协同作用会取得更好的疗效[29]。采用显微注射受精卵的方法进行基因转导是普遍使用的方法，但其效率较低。有人统计了已发表的转基因猪的材料可以看到，在培育过程中，转入基因的整合率为0.91%[30]。Laritrano等[31]用精细胞作为载体进行基因转移，从93头猪中成功地培育出53头转hDAF基因猪，成功率较高（57%），并证明了转移基因的拷贝数与表达情况不相关；此方法是将猪的精子与含hDAF基因的质粒共同孵育，再用人工授精的办法将基因转移至受精卵中，这为转基因猪的培育提供了新途径。最近Zaidi等[32]研究了一组转hDAF基因的猪肾移植给cynomolgus猴（猕猴属)的效果：7只转基因猪肾在猴子身上平均存活13d（6~15d），其中无HAR发生，有2只无任何排斥反应，5只发生了不同程度的排斥反应；对照组6只非转基因猪肾平均存活6.5d(0.3~30d)，均发生了排斥反应，但仅1只为HAR。此研究表明：转hDAF基因猪肾在灵长类动物身上存活可达35d，并保持了正常的血生化及酸碱体液平衡；但出乎意料的是，6只非转基因猪肾在这种猕猴身上仅一只发生了HAR，说明在非基因修饰猪异种肾移植时，HAR并非不可避免，对此尚无令人满意的解释；此外转hDAF基因猪似乎在预防急性血管排斥反应上也有重要意义。由于基因修饰异种肾移植目前仅为动物实验，很难断定这种移植在人类必然会引起HAR。研究还提示是否可以用这种猴子作为临床前期实验模型。3.异种肾的冷处理在取出猪的肾脏到吻合在人体之间的一段时间内，冷处理是十分重要的，一则可4以减轻热缺血损伤，二则可以洗去猪肾血管中的血液。很多研究试图发现最佳的保存温度，Savioz等[33]则从冷却速率出发，认为在异种肾移植过程中，冷却速率不宜1°C/min,冷却速率1°C/min时，细胞生存率（CVR）为75%，冷却速率1°C/min时，CVR为91%，但尚无证据表明CVR与移植肾功能之间的关系，该研究为异种肾