对复发性难治性慢性淋巴细胞白血病的持续缓解

嵌合抗原受体T细胞对复发性难治性慢性淋巴细胞白血病的持续缓解难治性或多次复发的慢性淋巴细胞白血病（CLL）的患者预后较差。靶向CD19的嵌合抗原受体（CAR）T细胞对B细胞恶性肿瘤的持续缓解，具有提高常规疗法低缓解率的潜力。我们曾经报道过3例难治性CLL治疗的初步研究结果。现在我们报道使用CAR-T细胞治疗的14例复发性难治性CLL患者的初步试验中成熟的研究结果。用慢病毒载体导入CD19CAR的自体T细胞（CTL019），输注给复发/难治性CLL患者，输注剂量为0.14×108到11×108CTL019细胞（平均1.6×108细胞）。对患者体内的CTL019进行毒性，应答，扩增和持续性进行监测。经多次治疗的CLL患者中，总有效率为8/14(57%)，其中4名患者完全缓解（CR），4名患者部分缓解（PR）。体内CAR-T细胞的扩增与临床应答相关，前2名获得CR的患者，体内CAR-T细胞功能持久保持超过4年。CR的患者疾病都没有出现复发。所有应答的患者出现B细胞再生障碍和细胞因子释放综合征都与CAR-T细胞的扩增相关。在获得CR的患者身上检测不到微小残留病灶，这表明了治愈晚期CLL患者成为可能。前言慢性淋巴细胞白血病（CLL）是成人白血病中最常见的类型。CLL的病程变化很大，总生存期为2年到20年。尽管有很多有效的疗法，但传统疗法CLL无法被治愈，病情恶化亦不可避免。虽然可通过同种异体造血干细胞移植来治愈部分患者，但这也有较高的发病率和死亡率，并且有许多CLL患者不适合移植治疗。难治性或多次复发的CLL患者预后较差，其总生存期由前期的无进展生存期决定。CD19嵌合抗原受体（CAR）修饰的T细胞是CLL和其他B细胞恶性肿瘤的一个不错的治疗方法。CAR是通过基因改造，由结合靶向抗体的单链可变区（scFv）与胞内信号和共刺激域组成的分子。早期尝试使用的CAR修饰的T细胞靶向恶性肿瘤，受到体内扩增和最低持续时间不足的限制，或因正常组织表达靶向抗原引起脱靶毒性。CTL019（以前称CART19）表达的CAR，由抗-CD19scFv与CD3ζ信号区和4-1BB（CD137）共刺激域构成，在小鼠模型中，这种CAR分子修饰的T细胞能持久表达并保持抗肿瘤活性。由于CD19只表达在正常和恶性B细胞表面，不表达于其他细胞，所以靶向正常细胞的毒性有限。我们和其他的研究者在之前的研究中发现，有少数患有复发或难治性CLL，急性淋巴细胞白血病（ALL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）的患者，在接受CD19CAR-T治疗后能保持长时间的完全缓解（CRs）。现在我们报告CTL019临床试验中14例患者成熟的结果。从我的研究中可以看出，CTL019在体内强力扩增后，表现出长期稳定的活性，部分复发性/难治性CLL患者获得深度缓解，持续缓解与活性的持久稳定相关。结果患者的状况23例CLL患者纳入本次研究，其中14例患者输注至少一个剂量的CTL019（见图S1）。9例没有进行治疗的患者中，3名在细胞输注前因并发症去世，4名主动退出，2名没有通过筛选。14例接受治疗的患者详情列于表1中。14例患者中，12例男性2例女性，平均年龄为66岁（年龄范围51~78岁）。之前患者平均接受过5次治疗（范围1-11）,8例患者染色体17p（TP53）缺失。1例患者接受2次自体干细胞移植，1例患者在ibrutinib治疗后疾病进展。所有患者在输注CTL019时处于疾病进展状态。在10例患者的骨髓活检报告中，淋巴细胞删除性化疗前骨髓中淋巴细胞比例平均为87%（范围40%-95%）。淋巴细胞删除性化疗方案中，氟达拉滨/环磷酰胺3例，喷司他丁/环磷酰胺5例，苯达莫司汀6例。表1.患者的基本情况摘要（N=14）CharacteristicsStatistics,n(%)N14Ageatinfusion(years)Mean(SD)66.9(8.1)Median(range)66(51–78)GenderMale12(85)Female2(14)No.ofprevioustherapiesMean(SD)5.3(2.8)Median(range)5(1–11)P53or17pdeletionNo8(57)Yes6(43)IGHVmutationNo9(64)Yes4(29)Unknown1(7)Lymphocyte-depletingchemotherapyBendamustine6(43)Fludarabine/cyclophosphamide3(21)Pentostatin/cyclophosphamide5(36)Lymphocytesinbonemarrowatenrollment(%)*Mean(SD)79.5(17.9)Median(range)87.5(40–95)Raistage15(36)49(64)BinetstageA1(7)B4(29)C9(64)*Datanotavailableforfoursubjects.CTL019制备的可行性和产品特性产品特性已在表S1中概括。除了1例患者，其余全部满足总有核细胞（TNCs）靶向制品的剂量范围1.5×107到5×109，患者接受TNCs平均剂量是7.5×108(范围1.7×108到50×108)。CTL019细胞是指改造的表达CAR的T细胞，14份制品的平均转导效率为20.1%（范围：4.7-39.2%），输注的CTL019总剂量平均为1.6×108细胞(范围,0.14×108-11×108)，分3天输完。8例患者（57%）完成了3天分散剂量输注方案；3例患者输注了1天（制备总量的10%），3例患输注了2天（制备总量的40%），而且在输注后不到24小时出现发烧，这跟输注细胞剂量的变化有一些关系。输注的细胞制品中CD4阳性细胞平均占81%（范围：68%~95%），CD8阳性细胞平均占20%（范围：4.6%~34%）。用流式细胞仪检测12例患者细胞制品靶向CD19阳性靶标的活性，测定脱颗粒来衡量细胞毒性，并检测胞内细胞因子的水平。12份制品都显示了靶向CD19的高细胞毒性，并高表达了大部分细胞因子，这说明了这些患者的CTL019表达了具有功能的CAR（图S2）。患者的治疗效果：疗效和生存率疗效评判以国际研讨会CLL组疗效标准为基准。此外，随着时间的推移，对每例患者进行免疫球蛋白重链（IGH）基因位深度测序分析，以用作血液和骨髓的疾病检测。最佳的总体应答率和疗效归纳于表2中。14例接受治疗的患者平均随访期为19个月（范围6~53个月）。8/14例患者（57%;置信区间(CI)精确到95%,29~82%）出现应答。4例患者完全缓解（CR）。患者获得CR并且没有出现复发平均为40个月（范围,21~53个月，从输注完毕开始计算）。缓解包括清除了微小残余病灶（MRD），对01、02、09号受试者在第1个月和对10号受试者在第三个月进行深度测序分析评估，在其血液和骨髓中没有发现CLL克隆的存在（表3，表S2）。CTL019输注后，其中3位患者仍然健在，保持疾病无复发23到58个月。09号受试者也获得CR，在CTL019输注后第15个月接受小腿基底细胞癌切除术，在CTL019输注后的第21个月,手术部位发生感染并导致了致命的绿脓杆菌败血症和脓包坏疽。在CTL019输注后的一个月内4例受试者（03,05,12和22）获得部分缓解（PR）,4例获得PR的患者平均应答持续时间为7个月（范围5-13个月）。其中2例患者（03和05）血象、骨髓和淋巴结都有好转，但他们在输注后4个月疾病进展。第12号受试者骨髓被广泛浸润，输血依赖，广泛淋巴结肿大，在接受治疗后获得PR。输注后，他体内的CTL019经过2次对数扩增，完全清除了血液和骨髓中的CLL，并且肿大的淋巴结消退＞50%。这例患者在T细胞输注6个月后死于大规模肺栓塞并发症，但是他的血液和骨髓中都没检测到CLL存在的证据。表2.受试者的治疗与临床表现（N=14）。DLBCL，弥漫大B细胞淋巴瘤;NED，没有疾病的证据;NR，无反应。MRD通过深度测序分析，在材料和方法中表述。表3.血液和骨髓IGH深度测序分析显示，受试者01和02CLL细胞和B细胞被清除。BM：骨髓；PB：外周血；Mo：月；Yr：年。尸检发现，肿大的腹部淋巴结取样中有残余的CLL浸润。22号受试者也存在广泛的骨髓浸润，循环性疾病和严重淋巴结肿大。CTL019输注后3个月，血液和骨髓中CLL被完全清除，肿大的淋巴结消退＞50%，获得PR并持续6个月。输注9个月后，其淋巴结迅速肿大，淋巴结活检显示为CD19阴性CLL弥漫大B细胞淋巴瘤（Richter’s征转化）。骨髓活检显示约有15%CLL浸润并大量转化为淋巴细胞。虽然在疾病进展时可以在血液和骨髓中通过定量聚合酶链反应（qPCR）可以检测到CTL019，而在发生转化和复发时，通过流式细胞仪在血液，骨髓和淋巴结活检中都检测不到CTL019。6例受试者在CTL019输注后没出现应答，6例受试者进展期在1到9个月内（平均4个月），这6例患者T细胞扩增受到阻碍（平均420copies/mg;范围6.5到13876或总CD3+T细胞的0.2%）。这些患者的CLL在体外培养不耐受裂解。这6例受试者中有2例已经死亡，1例在CTL019输注8个月后死于CLL并发症和感染，另1例在CTL019输注9个月和进行其他两项CLL治疗方案（ofatumumab和CHOP）后死于同种异体造血干细胞移植的并发症。其他4例受试者在CTL019输注9到15个月后仍然健在，他们都接受了其他替代治疗。14例患者白血病对CTL019的应答都通过IGH深度测序来评估（表3和表S2），有4例患者被确定产生响应：(i)CTL019输注后白血病克隆快速持续消失，MRD被清除(受试者01，02和09)。在输注后，对受试者01，02和09外周血DNA检测分别长达4年，2年和1年，在任何一次检测中都未发现白血病克隆；(ii)CTL019输注后3个月通过深度测序可确定随着分子水平缓解，CTL019输注会有MRD完全清除的延时性；(iii)有些患者会出现白血病克隆短暂的完全(受试者22)或不完全(受试者03，05，12，17和25)消失；(iv)在06，07,14和18受试者中CTL019未能导致IGH序列数和白血病克隆的降低。14例受试者总生存期平均约为29个月，总生存期18个月占71%(95%CI,40.6to88.2%)。无进展生存期平均约为7个月，无进展生存期18个月占28.6%(95%CI,8.8to52.4%)(图1和表S6).然而1例获得CR的受试者在输注21个月后死于感染并发症，获得CR的患者疾病没有再出现进展。其他所有患者在输注1到10个月后出现疾病进展或死于疾病复发引起的并发症。如图S1所示，这项研究筛选了23例患者，其中9例未接受治疗。5名患者未能入组，因为他们未能通过筛查或拒绝加入。因此，共18例患者加入，其中4例患者未接受治疗，因为他们在接受治疗前病情迅速恶化和（或）死亡（n=3），或有找到有利的替代治疗主动退出研究（n=1）。因为这种细胞治疗方式从入选到开始治疗会有延时，我们对18例入选者全部进行PFS分析。确认18例受试者中位PFS为9个月(95%CI,3~13.6)。患者的年龄，既往治疗的次数，入组阶段，染色体17p的缺失，IGHV突变量和CTL019细胞剂量与应答之间没有明显统计学差异(所有P0.05，表S3)。因为所有的患者都是晚期，不能确定疾病负荷与应答之间的关联。在治疗前我们对CLL上CD19的表达水平进行了分析，出现应答与没有出现应答的受试者CD19荧光强度均值没有区别，这说明靶标密度不能对应答进行预测。CTL019在体内的扩增与持久性用流式细胞术对CTL019细胞的持久性和定量检测（转导和CAR表达）来确定T细胞抗-CD19CAR的表达，通过qPCR来识别基因修饰的T细胞。扩增的程度和持久性的持续时间与应答呈正相关（图2和表S7）。在大多数情况下CTL019的扩增与细胞因子释放综合征（CRS）相一