微生物(酵母)的培养基优化

1实验一微生物(酵母)的培养基优化(指导教师:汪文俊熊海容王海英肖新才实验员:张继泰)一．实验目的：掌握微生物斜面培养基、种子培养基及发酵培养基确定方法，学会对已确定菌种确定实验室发酵工艺。二．实验原理生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。由于酵母在液体深层通气发酵过程中是以均一混浊液的状态存在的，所以可以采用直接比色法进行测定。三．仪器与试剂全恒温振荡培养箱，分光光度计、电热恒温水浴槽、天平、电炉。试剂为葡萄糖、蔗糖、酵母浸粉、KH2PO4。四．实验方法(1)、培养基的配制(见表1,2)表1正交表试验设计因素水平葡萄糖蔗糖酵母膏KH2PO411.00.00.50.522.01.01.01.033.02.02.02.0表2正交表实验方案编号葡萄糖(A)蔗糖(B)酵母膏(C)KH2PO4（D）生物量（OD）0h12h24h36h48h60h1(1)(1)(1)(1)2(1)(2)(2)(2)3(1)(3)(3)(3)4(2)(1)(2)(3)5(2)(2)(3)(1)6(2)(3)(1)(2)7(3)(1)(3)(2)8(3)(2)(1)(3)9(3)(3)(2)(1)（2）将上述培养基配制好以后，每250ml三角瓶装入培养基100ml，于121℃下灭菌30min，冷却。（3）冷却后接种（接种量为5％），置于28℃培养箱进行培养。2（4）测OD值：将接种0h、12h、24h、36h、48h、60h不同时间的菌悬液摇均匀后于560nm波长、1cm比色皿中测定0D值。比色测定时，用以未接种的培养基作空白对照，并将0D值填入表中，最终确定最佳培养基的组成及发酵时间。五．思考题(1)比浊计数在生产实践中有何应用价值?(2)本实验为什么采用560nm波长测定酵母菌悬液的光密度？如果你在实验中需要测定大肠杆菌生长的OD值，你将如何选择波长?实验二紫外线的诱变育种(指导教师:汪文俊熊海容王海英肖新才实验员:张继泰)一．目的要求通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。二．基本原理紫外线对微生物有诱变作用，主要引起是DNA的分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。三．菌种与仪器菌种：枯草芽孢杆菌(产胞外淀粉酶)；仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机四．操作步骤（1）菌悬液的制备（a）取培养48小时的枯草芽孢杆菌的斜面4—5支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。（b）将上述菌液离心（3000r/min，离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2—3次，最后制成菌悬液。（c）用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。（2）平板制作将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板，凝固后待用。（3）紫外线处理（a）将紫外线灯开关打开预热约20分钟。（b）取直径6cm无菌平皿2套，分别加入上述菌悬液5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿中。（c）将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟及3分钟。(4)稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。3(5)涂平板取10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0．1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。(6)培养将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养48小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。(7)计数将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。(8)观察诱变效应将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5—6个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜面可作复筛用。五．实验结果1．结果将实验结果填入下表。稀释倍数平均菌落处理时间（数/皿）诱变剂（min）10-410-510-6存活率%致死率%紫外线（UV）0（对照）13结果处理透明圈和菌落直径大小（㎜）及其HC比值123456透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值UV处理4对照六．思考题(1)用于诱变的菌悬液（或孢子悬液）为什么要充分振荡？(2)经紫外线处理后的操作和培养为什么要在暗处或红光下进行？实验三玉米淀粉液化及糖化(指导教师:汪文俊熊海容王海英肖新才实验员:张继泰)一、实验目的掌握用酶法从淀粉原料到水解糖的制备原理及方法。掌握粗淀粉含量和还原糖的化学测定方法。二、实验原理发酵过程中，有些微生物不能直接利用淀粉，因此，当以淀粉为原料时，必须先将淀粉水解成葡萄糖，才能供发酵使用。一般将淀粉水解为葡萄糖的过程称为淀粉的糖化，所制得的糖液称为淀粉水解糖。发酵生产中，淀粉水解糖液的质量，与生产菌的生长速度及产物的积累直接相关。可以用来制备淀粉水解糖的原料主要有薯类(木薯、甘薯)淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉等，根据原料淀粉的性质及采用的水解催化剂的不同，水解淀粉为葡萄糖的方法可分为酸解法、酸酶结合法和酶解法。实验室中常采用酶解法制备淀粉水解糖。酶解法是指利用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖的过程。酶解法制葡萄糖可分为两步：第l步是利用α-淀粉酶将淀粉液化为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，这个过程称为液化；第2步是利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖的过程，在生产上称为糖化。淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下进行的，故也称为双酶水解法。2.1酶法液化原理淀粉的酶法液化是以α-淀粉酶为催化剂，该酶作用于淀粉的α-1,4糖苷键，从内部随机地水解淀粉，从而迅速将淀粉水解为糊精及少量麦芽糖，所以也称内切淀粉酶。淀粉受到α-淀粉酶的作用后，其碘色反应发生如下变化：蓝→紫→红→浅红→不显色(即碘原色)。酶法液化以生产工艺不同分为间歇法，半连续和连续式；液化设备有：管式、罐式、喷射式。加酶方法有：一次加酶、二次加酶、三次加酶。根据酶制剂的耐温性分为中温酶法、高温酶法、或中温酶和高温酶混合法。本实验采用：高温酶法，间歇式，罐式，二次加酶法。2.2酶法糖化原理淀粉的糖化是以糖化酶为催化剂，该酶从非还原末端以葡萄糖为单位顺次分解淀粉的α-1，4糖苷键或α-1，6糖苷键。因为是从链的一端逐渐地一个个地切断为葡萄糖，所以称为外切淀粉酶。淀粉糖化的理论收率：因为在糖化过程中，水参与反应，故糖化的理论收率为111.1％。（C6H10O5)n+H2OnC6H12O616218180淀粉糖化实5际收率：实际收率的计算公式：淀粉转化率：淀粉-葡萄糖转化率是指100份淀粉中有多少份淀粉被转化为葡萄糖。淀粉转化率的计算：DE值：用DE值表示淀粉水解的程度或糖化程度。糖化液中还原性糖以葡萄糖计，占干物质的百分比称为DE值。DE值计算：还原糖用DNS法测定，浓度表示：葡萄糖g/100ml糖液；干物质用阿贝折光仪测定，浓度表示：干物质g/100g糖液。影响DE值的因素：糖化时间：最初糖化时，糖化速度快，DE值显著上升；但24h后，当DE值达到90％以上时，糖化速度显著放慢。液化DE值与糖化DE值的关系：液化程度应控制适当，太低或太高均不利。原因是液化程度低，则粘度大，难操作；同时，由于液化程度低，底物分子少，水解机会少，影响糖化速度；液化程度低，易发生老化；但液化超过一定程度，则不利于糖化酶与糊精生成络合结构，影响催化效率，造成糖化液的最终DE值低。故应在碘试本色的前提下，液化DE值越低，则糖化液的最高DE值越高。一般液化DE值应控制在12-18％。酶制剂用量与糖液DE值的关系：糖化时间与糖化酶用量关系表糖化时间（h）68101624324872糖化酶用量（U/g淀粉）480400320240180150120100为加快糖化速度，可以提高酶用量，缩短糖化时间。但酶用量太高，反而使复合反应严重，最终导致葡萄糖值降低。在实际生产中，应充分利用糖化罐的容量，尽量延长糖化时间，减少糖化酶用量。糖化酶参考用量：液化DE值17％，淀粉乳33％，60℃，pH4.5，酶制剂240U/g绝干淀粉。糖化时间16h。三、实验仪器、设备和材料%100(%))(原料中纯淀粉含量投入淀粉量糖液葡萄糖含量糖液量收率L%10011.1(%))(原料中纯淀粉含量投入淀粉量糖液葡萄糖含量糖液量转化率L%100%%）干物质含量（）还原糖含量（值DE6（1）25升罐；（2）小型板框过滤机压滤；（3）烘箱；（4）水桶；（5）量筒；（6）分光光度计；（7）水浴锅；（8）滴定管；（9）电炉；（10）白瓷板；（11）三角瓶；（12）阿贝折光仪；（13）玉米粉；（14）高温α-淀粉酶；（15）糖化酶；（16）pH试纸；四、实验方法4.1淀粉的液化配制30％的淀粉乳（按15升配制），调节pH值至6.5，加入氯化钙(对固形物0.2％)，加入液化酶(12-20U/g淀粉)，在剧烈搅拌下，先加热至72℃，保温15min，再加热至90℃，并维持30min，以达到所需的液化程度(DE值：15-18％)，碘反应呈棕红色。液化结束后，再升温至120℃，保持5-8min，以凝聚蛋白质，改进过滤。4.2淀粉的糖化液化结束后，迅速将料液用烟酸将pH调至4.2-4.5，同时迅速降温至60℃。加入糖化酶，60℃保温若干小时后，当用无水酒精检验无糊精存在时。将料液pH调至4.8-5.0，同时，将料液加热至80℃，保温20min．然后将料液温度降至60-70℃，开始过滤。4.3过滤在发酵罐内将料液冷却至60-70℃；洗净板框过滤机，装好滤布；接好板框压滤机的管道；泵料过滤；热水洗涤(60-70℃)；空气吹干；过滤结束后，洗净过滤机及有关设备。量取糖液体积；取样分析还原糖浓度。五、数据处理在详细记录实验数据的基础上完成实验报告。计算淀粉转化率。六、实验结果和讨论糖化酶用量及糖化时间对糖化效果的影响；液化和糖化时温度及pH对实验效果的影响。附录11、残糖含量测定3,5-二硝基水杨酸比色定糖法一、原理：本实验是利用3,5-二硝基水杨酸溶液与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物．在一定范围内还原糖的量和棕红包物质颜色深浅的程度成—定比例关系．可用于比色测定。葡萄糖与3,5-二硝基水杨酸试剂反应生成的有色物质在520nm处有最大吸收峰，故在此波长下进行比色。二、实验步骤：1．标准曲线制作取6支大试管，从0~5分别编号，按下表加入各种试剂。试剂管号70123451mg/mL葡萄糖溶液（mL）00.20.40.60.81.0蒸馏水（mL）1.00.80.60.40.20DNS试剂（mL）0.50.50.50.50.50.5将各管溶液振荡混匀后，在沸水浴中准确煮沸5min，取出迅速用冷水冷却至室温，加入蒸馏水15mL，摇匀。在520nm波长下，用空白调零测定吸光值，测定吸光值。以吸光值为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标绘制标准曲线。2．样品测定取培养基5mL，5000r/min离心5min，取上清液1mL于试管中，加入0.5mLDNS试剂，同以上操作，测吸光值，用Origin软件绘制标准曲线，并求出各个时期样品的葡萄糖含量。实验四淀粉酶的固定化生产(指导教师:汪文俊熊海容王海英肖新才实验员:张继泰)一、实验目的：学习细胞固定化的原理，通过海藻酸钠包埋固定产淀粉酶的枯草芽孢杆菌，掌握菌体包埋固定的基本方法，了解固定化细胞在实际中的应用。二、实验原理：细胞固定化克服了传统游离细胞发酵的不足，本实验以海藻酸钠为载体，以CaCl2为交联剂，进行固定化枯草芽孢杆菌。海藻酸钠是从海藻提取获取的藻酸盐，为D-甘露糖醛酸和古洛糖醛酸的线性共聚物，多价